变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术在分析动物肠道菌群多样性中的应用

李峪鹏，许祯莹，李娟，苏志鹏，刘瀚扬，朱佳文*

（1.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130；2.四川省成都市农林科学院，四川 成都 611130；3.四川特驱投资集团有限公司，四川 成都 610207）

近年来，有很多关于动物肠道微生物菌群组成与其自身健康息息相关的报道。研究者们利用下一代测序工具（NGS）对肠道微生物菌群的组成进行快速且精确的研究。16S rRNA分析技术是最常用来分析微生物多样性的工具，它可以利用相关区域的变异性对菌群组成的差异性进行分析。变性凝胶梯度电泳（PCR-DGGE）技术在16S rRNA技术的基础上进一步对微生物多样性进行分析，其原理是利用相同大小DNA片段不同的碱基序列，让DNA片段通过由低到高的变性梯度凝胶进行电泳，当DNA分子迁移到不同变性浓度的聚丙烯酰胺凝胶时，不同序列的DNA片段会停留在不同浓度的凝胶位置。

1 PCR-DGGE技术的优缺点

PCR-DGGE技术具有快速高效检测突变DNA片段的优点，并且重复性好，目前已在畜牧行业中广泛应用。在使用DGGE工具时，需要提取样品的总DNA，并设计带有CG的夹板引物，对DNA的可变区域（V1、V1-V3、V3、V4-V5、V3-V5、V6-V8a、V6-V8b、V8）进行PCR扩增，通过DGGE指纹图谱进行特异性分析，建立系统发育树，最终得到微生物菌群的差异性。虽然PCRDGGE技术比16S rRNA和ERIC-PCR略为复杂，但精确度更高、重复性更好。有学者分别利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技术对喂服枯草芽孢杆菌的肉鸡肠道菌群进行研究，结果得出：虽然两种方法检测结果均显示饲喂枯草芽孢杆菌能提高肉鸡肠道微生物的丰度和种群密度[1]，但从指纹图谱和统计条带数量上来看，PCR-DGGE技术优于ERIC-PCR技术[2]。然而PCR-DGGE技术仍然有着局限性：在DNA的保存与提取时，若方法不当则会造成DNA降解，引起实验误差；在研究复杂生态环境系统时，往往会有种类复杂的微生物组成，DGGE图谱只有其中的优势菌群才会呈现出条带，而含量低于1%以下的弱势菌群不会被检出；并且该方法依赖于基因数据库，如果数据库中序列信息不够则也会受到限制。

2 PCR-DGGE技术的具体分析方法

2.1 粪便样品保存 粪便样品的保存方法直接影响DNA降解程度，而分子生物学分析的可信度依赖于DNA模板的降解程度。目前可靠的粪便保存方法包括低温保存[3]、福尔马林保存、硅珠保存、DETs保存、干燥保存、乙醇保存等[4]。在需要长时间保存DNA时，一般选择乙醇保存法，可以在数月到数年内保存较高质量的DNA样本，而在较短时间内保存DNA，使用低温保存法即有不错的效果[5]。

2.2 样品中的DNA提取 采用市场上成熟的DNA提取试剂盒对动物粪便样品中的DNA进行提取。提取到的DNA使用细菌16S rRNA基因通用引物27F和1492R对粪便样品总DNA进行第一轮PCR扩增，扩增产物经过一定比例稀释作为模板，再用特异性引物（例如针对细菌16S rRNA基因V3区域的特异片段进行GC引物设计）进行巢氏PCR扩增，扩增产物用于后续DGGE分析。

2.3 电泳分析 在变性剂梯度为40%～60%，电压60 V和60 ℃条件下电泳14 h后，用相应的核酸染料染色并用Quantity One等软件进行DGGE图谱聚类分析。计算每个样品中微生物的多样性指数：丰度（S）、指数（H）和均匀度（E）。S为丰度，即每一条泳道的条带数目，H和E的计算公式为：H＝∑PilnPi，Pi＝Ni∕N，Ni表示样品上第i个条带的吸收峰面积，N表示样品中所有条带吸收峰的总面积；E＝H∕lnS。从DGGE凝胶中选取明显或优势条带进行割胶回收，并进行测序分析。测得的序列与NCBI数据库进行比对，用MEGA等软件对序列进行配比分析和系统发育树构建。

3 PCR-DGGE技术在分析动物肠道微生物多样性中的应用

3.1 动物肠道菌群多样性分析的重要性 动物肠道中栖息着的大量微生物在消化吸收、能量代谢、免疫调节、抗病能力等方面发挥着重要作用，正常情况下肠道菌群处于一个平衡状态，对以上生理功能起着保护、促进作用，但是当菌群的数量、种类、比例等各方面失调时就会引起疾病，严重的会引起动物死亡[6]。研究动物肠道菌群多样性，通过分析动物肠道菌群的丰度以及结构组成，进一步了解动物各种疾病病因、生长发育速度与肠道微生物之间的关系，从而为预防和治疗肠道疾病提供合理的理论依据。目前已有微生态制剂开始应用于预防和治疗疾病，提高动物生产性能等方面[7-8]。

3.2 应用案例 Suchodolski等[9]分别从犬只十二指肠、空肠、回肠、结肠和直肠中收集肠道内容物，通过PCR-DGGE技术评价了犬肠道内不同区域和不同犬只间细菌菌群的差异，通过计算Simpson多样性指数、Shannon-Weaver多样性指数和均匀度来评价细菌的多样性，结果表明，不同犬只肠道菌群的优势微生物不同，存在明显的差异性。Lubbs等[10]利用PCR-DGGE技术检测成年猫日常蛋白质摄入量对胃肠道菌群变化的影响，发现高蛋白会引起微生物种群的急剧变化，在双歧杆菌数量减少的高蛋白饮食中可以通过益生菌进行调节。脱氧雪烯醇是一种霉菌毒素（DON），是很多国家面临的食品安全问题，有学者通过PCR-DGGE技术利用常规微生物选择策略，从鸡肠道中分离出了脱氧雪兰素转化菌，大大提高了细菌选择的效率。因此，采用PCR-DGGE技术引导肠道细菌转化是一种高效的方法[11]。

Liu等[12]用PCR-DGGE和克隆文库方法分别分析了中国对虾肠道微生物的多样性，得到了相似的结果，主要以弧菌为主，证明了两种不同的分子生物技术在一定程度上具有代表性。2016年，冯方周等[13]采用PCR-DGGE技术研究雏鸡大肠杆菌感染模型，发现随着雏鸡日龄增加，其肠道菌群多样性也逐渐增加，肠球菌、大肠杆菌、葡萄球菌以及梭菌均有出现，在感染大肠杆菌后，图谱条带出现增加或缺失的现象，而噬菌体作用后的有些条带日渐恢复正常。由于养鸭业的快速发展，大部分鸭群排泄物直接进入到人类赖以生存的生活环境中，因此有学者利用PCR-DGGE技术分析鸭场水样样本中的细菌群落结构，客观地反映鸭场环境微生物多样性的特点，为防治细菌性疾病提供理论依据[14]。

为了研究獭兔腹泻后盲肠菌群结构的变化情况，周毅等[15]应用PCR-DGGE和Real-Time PCR分析健康獭兔与腹泻獭兔盲肠菌落的差异性，发现獭兔腹泻后盲肠有益微生物数量降低，有害微生物数量增加，但是菌群结构差异不明显。2018年，为研究海参花酶解物对小鼠肠道微生物的影响，有学者采用PCR-DGGE技术分析其微生物群落结构及动态变化，发现对照组样品中拟杆菌门、变性菌门为小鼠肠道的优势菌群，随着海参花酶解物浓度的增加，小鼠肠道菌群中的幽门螺旋杆菌属含量降低，厚壁菌门乳酸杆菌属含量增加，说明海参花酶解物对调节小鼠肠道菌群有一定的作用[16]。

4 小结

研究动物肠道菌群是研究动物营养水平的基础，是现代畜牧业抗生素替代策略必不可少的途径。肠道微生物多样性受宿主环境变化的影响非常大，PCR-DGGE技术可以在16S rRNA技术基础上进一步对微生物多样性进行分析，并具有一定的优势，在追踪肠道微生物菌群结构特征和监测生物种群动态中具有重要的作用，能更好地为人类了解和监测动物肠道微生物稳态提供帮助。