急性胰腺炎患者血清IL－6、IL－10水平变化及其与淋巴细胞自噬凋亡的相关性

潘静，覃月秋，徐晨阳，梁云轩，宋嗣恩，季科，杨复锵，周喜汉，黄赞松

(右江民族医学院附属医院，广西百色533000)

急性胰腺炎(AP)是临床常见的急腹症，近年来发病率逐渐升高。目前，AP的发病机制尚未完全阐明。炎症反应、异常自噬及凋亡可能在AP的发病中起着重要作用。作为经典炎症因子，白细胞介素6(IL－6)、IL－10对维持机体促炎—抗炎平衡状态起着重要的作用［1]。淋巴细胞自噬、凋亡异常可使AP机体淋巴细胞亚群减少，免疫功能下降［2，3]。微管相关蛋白1轻链3(LC3)、凋亡相关因子半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(Caspase－3)分别是调控细胞自噬、凋亡最重要的因子，LC3、Caspase－3水平的升高提示机体自噬、凋亡系统异常激活［4，5]。目前炎症反应与淋巴细胞自噬、凋亡异常在AP发病机制中的相互作用机制尚不清楚，炎症信号传导机制激活，导致自噬、凋亡异常激活，淋巴细胞数量减少，可能是AP患者免疫功能受损的重要原因之一。我们观察了 AP患者外周血 IL－6、IL－10、LC3、Caspase－3水平，并分析其与患者淋巴细胞自噬、凋亡的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年1月～2018年12月间右江民族医学院附属医院收治的AP患者73例，其中轻症急性胰腺炎(MAP，MAP组)25例，男15例、女10 例，年龄(48.56 ±14.16)岁;中度重症急性胰腺炎(MSAP，MSAP组)25例，男14例、女11例，年龄(48.60 ±12.65)岁;重症急性胰腺炎(SAP，SAP组)23例，男 15例、女 8例，年龄(49.52±16.47)岁。AP诊断均符合中华医学会消化病学分会2013年制订的《中国急性胰腺炎诊治指南》［6]中的诊断标准，排除合并肿瘤、肝肾功能不全、血液系统疾病、心脑血管疾病患者、自身免疫性疾病、妊娠或哺乳期妇女。另选择健康体检者25例为对照组，其中男12例、女13例，年龄(44.32±4.99)岁。各组年龄、性别比例具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准同意，纳入者均签署知情同意书。

1.2 试剂及仪器 FACS Calibur流式细胞仪、淋巴细胞凋亡FITC Annexin V Apoptosis Detection KitⅠ荧光双染试剂、自噬试剂Autophagy Assay Kit以及溶血素均购于美国 BD公司，人IL－6(EHC007(H).96)、IL －10(EHC009(H).96)试剂检测盒购于欣博盛科技有限公司，人LC3(m1062954.96)试剂检测盒购于上海酶联生物科技有限公司，人Caspase－3(CSB－E08856h－96T)试剂检测盒购于武汉华美生物工程有限公司。

1.3 各组血清 IL－6、IL－10检测 采用 ELISA法。AP患者入院24 h内采集外周血5 mL，对照组于体检时采集外周血5 mL，采用多功能酶标仪检测两组IL－6、IL－10，操作步骤严格按照ELISA试剂盒说明书进行，绘制标准曲线，将样品光密度值代入标准曲线，最终测算血清IL－6、IL－10。重复3次，取平均值。

1.4 各组血清LC3及淋巴细胞自噬情况观察①血清 LC3检测：采用 ELISA法检测各组血清LC3，所有操作均同“1.3”，重复3次，取平均值。②淋巴细胞自噬率测算：取各组外周血，淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，1×Wash buffer清洗细胞1次，离心后弃上清;加入适量的1×Wash buffer重悬细胞，计数并调节细胞浓度至1×106mL;加入MDC Stain 100 μL，轻轻混匀，37 ℃避光孵育15 min，加入 Collection buffer400 μL重悬细胞，1 h内于流式细胞仪中测算各组淋巴细胞自噬率(于FSC－SSC点图设矩形门R1排除碎屑，再作MDC FL1H－SSC点图，以正常对照组右侧象限3%细胞设矩形门R2，并复制R2于各病例组点图中统计R2阳性率改变，即为AP患者自噬率)。重复3次，取平均值。

1.5 各组血清Caspase－3及淋巴细胞凋亡情况观察 ①血清Caspase－3检测：采用ELISA法检测各组血清Caspase－3，所有操作均同“1.3”，重复3次，取平均值。②淋巴细胞凋亡率测算：取各组外周血，分离淋巴细胞，将其配成淋巴细胞数为1×106～5 ×106/mL;加入Annexin－V FITC、PI各5 μL，避光孵育15 min，加入1×buffer 400 μL重悬细胞，1 h于流式细胞仪测算各组淋巴细胞凋亡率(流式细胞仪散点图活细胞百分率位于左下象限FITC－/PI－，坏死细胞百分率位于右上象限FITC+/PI+，凋亡细胞百分率位于右下象限FITC+/PI－)。重复3次，取平均值。

1.6 统计学方法 应用SPSS 23.0统计软件进行处理。计量资料用±s表示，两两比较采用两独立样本t检验。AP患者血清IL－6、IL－10水平与血清LC3、Caspase－3水平的相关性分析采用Pearson相关分析法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清 IL－6、IL－10水平比较 MAP、MSAP、SAP组及对照组血清IL－6分别为(8.37±2.27)、(15.08 ± 3.90)、(27.90 ± 7.45)、(4.91 ±1.24)pg/mL，血清 IL －10 分别为(20.51 ±4.74)、(15.61 ± 3.67)、(10.64 ± 4.12)、(5.87 ± 4.05)pg/mL。与对照组比较，MAP、MSAP、SAP组血清IL－6、IL－10水平升高，与 MAP组比较，MSAP组血清IL－6水平升高、IL－10水平降低(P均＜0.05)，与MSAP、MAP组比较，SAP组血清 IL－6水平升高、IL－10水平降低(P 均 ＜0.05)。

2.2 各组血清LC3水平及淋巴细胞自噬率比较MAP、MSAP、SAP组及对照组血清 LC3分别为(211.09 ± 80.19)、(382.69 ± 61.65)、(548.37 ±229.06)、(180.75 ± 55.43)pg/mL，与 MSAP、MAP及对照组比较，SAP组血清LC3水平升高(P均＜0.05);与MAP组、对照组比较，MSAP组血清 LC3水平升高(P 均 ＜0.05)。MAP、MSAP、SAP组及对照组淋巴细胞自噬率分别为10.42% ±2.64%、15.46% ± 3.27%、25.81% ± 5.39%、9.34% ±2.67%，与MAP、MSAP组及对照组比较，SAP组淋巴细胞自噬率升高(P均＜0.05)，与MAP组、对照组比较，MSAP组淋巴细胞自噬率升高(P均 ＜0.05)。

2.3 各组血清Caspase－3水平及淋巴细胞凋亡率比较 MAP、MSAP、SAP组及对照组血清Caspase－3 分别为(1.68 ±0.63)、(4.67 ±2.31)、(6.36 ±1.91)、(1.42 ±0.52)ng/mL，与 MSAP、MAP 及对照组比较，SAP组血清Caspase－3水平升高(P均＜0.05);与MAP及对照组比较，MSAP组血清Caspase－3水平升高(P 均 ＜0.05)。MAP、MSAP、SAP 组及对照组淋巴细胞凋亡率分别为3.12% ±1.35%、6.01% ±2.41、8.73% ±4.58%、2.41% ± 1.06%，与MAP、MSAP组及对照组比较，SAP组淋巴细胞凋亡率升高(P均＜0.05)，与MAP组、对照组比较，MSAP组淋巴细胞凋亡率升高(P均＜0.05)。

2.4 AP患者血清IL－6、IL－10水平与血清 LC3、Caspase－3水平的相关性 MSAP、SAP组患者血清IL－6水平与血清LC3、Caspase－3水平呈正相关(r分别为 0.990 4，0.981 3，P 均 ＜ 0.05;r分别为 0.978 5，0.987 0，P 均 ＜0.05)，血清 IL －10 水平与血清LC3、Caspase－3水平呈正相关(r分别为0.933 1，0.973 2，P 均 ＜0.05;r=0.987 8，0.866 3，P 均 ＜0.05)。

3 讨论

目前认为，多种炎症介质参与了AP炎症反应过程，包括 TNF －α、IL －6、IL －1、黏附分子、血小板活化及趋化因子等促炎因子，以及IL－10、IL－4、转化生长因子－β1(TGF－β1)等抗炎因子［7]。作为经典炎症因子，IL－6主要介导体内免疫应答的调节以及急性期反应及造血功能，在机体免疫反应中可以通过刺激IL－10分泌而起到抗炎作用［8];IL－10可抑制局部和系统炎症，能够减轻AP患者体内的炎症反应，两者在AP发生发展中起着重要作用［9]。本研究结果发现，AP各组血清IL－6水平均较对照组升高，SAP组较MSAP、MAP组升高;MSAP组较MAP组升高。AP各组血清IL－10水平均较对照组升高，但SAP组较MSAP及MAP组低;MSAP组较MAP组低。说明在AP患者早期机体即存在炎症反应，随着病情进展，大量炎症介质被激活，促炎因子不断释放，IL－6水平不断升高，机体炎症反应剧烈，胰腺损伤越重，此时抗炎因子IL－10作为保护性机制亦随之升高［10]。在AP早期，机体释放的IL－10尚足以抵抗炎症因子所致的损伤，促炎－抗炎反应仍处于平衡状态。当发展为SAP，炎症反应不断加剧，IL－10不断消耗，当抗炎因子IL－10水平释放不足、过度消耗时，IL－10水平降低，可使促炎－抗炎反应失衡，进一步引发SIRS，SAP病情进一步加重。我们前期研究发现，IL－6、IL－10水平与AP病情严重程度相关。

近年研究［11]发现，剧烈炎症反应、异常自噬及凋亡在AP发生发展中起重要作用，AP尤其是SAP机体存在剧烈炎症反应，随着大量炎症介质产生，机体免疫受损，出现免疫抑制;而过度自噬、凋亡导致淋巴细胞数量减少，AP免疫功能受损，易诱发感染、脓毒症等，加重病情［12]。AP时持续过度的炎症反应，可导致腺泡细胞Ca2+浓度增加、氧化应激加重，进一步导致细胞因子和炎症介质的瀑布样释放，引起自噬、凋亡异常激活，使AP病情加重［13]。本研究检测了AP患者及对照组血清LC3、Caspase－3水平、淋巴细胞自噬率及凋亡率，结果显示SAP组血清LC3、Caspase－3水平、淋巴细胞自噬率及凋亡率较对照组、MAP组及 MSAP组升高，MSAP组较MAP及对照组升高，差异具有显著性，而MAP组较对照组仅轻度升高，与对照组比较差异无显著性。提示在MSAP及SAP中存在LC3、Caspase－3水平异常升高，自噬、凋亡增强。进一步分析结果显示MSAP及SAP患者外周血LC3、Caspase－3水平与自噬率、凋亡率呈显著正相关。随着LC3、Caspase－3水平的升高，AP自噬率、凋亡率增加。提示MSAP尤其是SAP患者体内LC3、Caspase－3水平表达升高，淋巴细胞自噬、凋亡激活。相关分析结果还显示，MSAP、SAP组 IL－6、IL－10水平与 LC3、Caspase－3水平呈显著正相关，说明随着炎症因子IL－6、IL－10水平升高，机体炎症反应加剧，促使LC3、Caspase－3表达增强，机体淋巴细胞自噬及凋亡增加，AP病情加重。因此，有效控制炎症反应，降低LC3、Caspase－3表达水平，抑制淋巴细胞异常自噬、凋亡，将有可能成为改善AP尤其是SAP患者病情的有效方法。

综上所述，MAP、MSAP、SAP 患者血清 IL －6、IL－10、LC3、Caspase－3 水平均升高。MAP、MSAP、SAP患者炎症反应水平升高，淋巴细胞自噬、凋亡水平增强。MSAP、SAP血清IL－6、IL－10水平与血清LC3、Caspase－3水平呈正相关。血清 IL－6、IL－10可能促进AP患者淋巴细胞的自噬、凋亡，在AP的发生发展中发挥重要作用。