自拟放射性肠炎灌肠液灌肠对急性放射性肠炎小鼠肠道黏膜屏障损伤的预防及治疗作用观察

汪涛，刘梅，杨华良，李德冠

(1天津市中心妇产科医院，天津300100;2北京协和医学院，中国医学科学院放射医学研究所)

肿瘤切除术后盆腔内、外放射治疗是治疗女性子宫颈癌及子宫内膜癌的重要辅助手段［1]，而盆腔恶性肿瘤放疗野因包含消化道结构，而消化道上皮细胞的增殖活跃，易受到放、化疗的影响，进而出现小肠、结肠和直肠等消化道不良反应，这些不良反应会限制患者放、化疗的最大耐受剂量，降低治疗效果。轻者症状可耐受并能自行愈合，重者症状持续较长时间且伴有出血、狭窄或形成瘘，严重者可导致患者死亡［2，3]。放疗不良反应可发生在治疗中任意时间，肠道急性不良反应常发生于治疗前几周，数月或数年后会发生慢性损伤，而晚期不良反应往往代表持久而不可逆的放疗相关组织改变［4]。目前临床对于放射性肠道损伤的药物治疗主要为对症，2018年《中国放射性直肠炎诊治专家共识》［5]中推荐的药物治疗方案包括肠炎急性期使用柳氮磺胺吡啶等药物，使用抗生素、益生菌、洛哌丁胺等口服治疗腹泻症状，使用硫糖铝、糖皮质激素等保留灌肠治疗出血。最新研究［6，7]认为，中药是预防与治疗放射性肠炎的有效方法之一，特别是中药保留灌肠，灌肠液一方面可直接注入直肠，在肠黏膜处直接吸收，药物局部浓度高，起效快;另一方面，药物混合于直肠液中，经直肠静脉直接进入体循环，避免肝脏首过效应，在发挥局部治疗作用的同时还具有全身治疗作用［8]。为此，我们依据中医理论证型自拟放射性肠炎灌肠组方，并观察其灌肠对急性放射性肠炎模型小鼠肠道黏膜屏障修复及治疗作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、药物、试剂及仪器 C57BL/6J小鼠64只，SPF级，雌性，购自北京华阜康生物科技有限公司，体质量20.0～22.0 g。所有动物均在同等条件下饲养，自由饮水和摄食。自拟放射性肠炎灌肠液组方为黄芩、黄连、黄柏、白花蛇舌草、白头翁、蒲公英、粉葛、秦皮、生地榆、败酱草、乌药、延胡索。

1.2 急性放射性肠炎模型制备及自拟放射性肠炎灌肠液灌肠方法 小鼠随机分为对照组、照射组、预防组和治疗组，每组各16只。对照组不予照射，照射组、预防组和治疗组接受腹部局部12 Gy(137Cs γ射线辐射源，购自加拿大原子能有限公司，剂量率为0.99 Gy/min)照射1次制备急性放射性肠炎模型。预防组在照射前3天起用自拟放射性肠炎灌肠，1次/d，造模当日继续灌肠4 d，共灌肠7次;治疗组在造模当日当日用自拟放射性肠炎灌肠，1次/d，共灌肠7次;对照组、照射组自造模当日均予等量生理盐水灌肠，共灌肠7次。灌肠方法为由肛门插入软管约4 cm，然后注入灌肠液0.3 mL(经人－鼠等效量折算［9])，留置20 s后拔出灌肠器，再将小鼠倒置30 s，小鼠无需麻醉。

1.3 各组小鼠小肠组织隐窝细胞数及绒毛形态、长度测算 造模第3天时各组均取6只小鼠，颈椎脱臼处死小肠组织制作石蜡块。采用苏木素－伊红法进行HE染色，Image J 1.37分析软件测算各组小肠绒毛隐窝细胞数。另取部分小肠组织，免疫组化Villin染色后抗原微波修复，封片，Image J 1.37分析软件观察小肠绒毛形态、测算小肠绒毛长度。重复3次，取平均值。

1.4 各组小鼠生存情况观察 观察各组小鼠造模第15天时生存情况。

1.5 统计学方法 采用统计学软件SPSS 17.0进行数据分析，计量资料用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验;计数资料比较用χ2检验或Fisher精确概率法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小肠组织隐窝细胞数比较 对照组小肠隐窝深遂，而照射组小肠隐窝排列发生变化，隐窝深度降低，预防组和治疗组隐窝排列情况要优于照射组。

对照组、照射组、预防组和治疗组小肠组织隐窝细胞数分别为(16.90 ± 5.55)、(6.90 ± 3.51)、(10.30 ±2.21)、(3.40 ±2.91)个/cm，与对照组比较，照射组、预防组和治疗组小鼠小肠组织隐窝细胞数降低(P均＜0.05)，与照射组比较，预防组小鼠小肠组织隐窝细胞数升高，治疗组小肠组织隐窝细胞数降低(P均＜0.05)。

2.2 各组小肠组织绒毛形态及长度比较 对照组小肠绒毛上皮细胞整齐，形态正常，排列有序，腺体丰富。照射组小肠绒毛长度明显比对照组肠绒毛长度减少，照射组明显比预防组肠绒毛长度少，见图2。对照组、照射组、预防组和治疗组小肠组织绒毛长度分别为(585.32 ±21.39)、(227.22 ±44.36)、(386.43 ±56.48)、(189.42 ±39.90)μm，与对照组比较，照射组、预防组和治疗组小肠组织绒毛长度降低(P均＜0.05)，与照射组比较，预防组小肠组织绒毛长度升高，(P均＜0.05)。

2.3 各组小鼠生存情况观察 造模第15天时，对照组、照射组、预防组和治疗组小鼠分别存活10、3、5、4只，与对照组比较，照射组、预防组和治疗组小鼠存活只数少(P均＜0.05)，与照射组比较，预防组小鼠存活只数多(P均＜0.05)。

3 讨论

放射性肠炎在古代中医文献中并无明确记载，但其临床症状与古代中医的肠游、泄泻、痢疾十分相似［10]，2017年发布的《放射性直肠炎(肠澼)中医诊疗专家共识》中提出放射性直肠炎中医病名命名为“肠澼”，急性期以热毒伤络型多见，慢性期多见寒热错杂［11]。本研究中使用的灌肠液，处方功效为清热、凉血、止血、止痛，用以缓解和治疗患者由于放射线照射后肠道蕴热、气血壅滞、湿性黏滞引起的不同程度的腹痛，腹泻、便血等症状。灌肠剂组方中黄芩、黄连、黄柏可清热燥湿、泻火解毒;白花蛇舌草利湿通淋;白头翁、葛根、秦皮可凉血止痢、升阳止泻、收敛止痢;蒲公英消肿散结;地榆凉血止血;败酱草、乌药、延胡索可活血、祛瘀、行气、止痛。组方以收敛、解痉、消炎、保护肠黏膜、促进损伤修复和止血为主，定位于改善疾病及远期疗效(预防复发)。

小肠绒毛上皮细胞，特别是隐窝干细胞，对放疗的早期效应非常敏感［12]，虽然在剂量一定限度内，小肠可通过隐窝干细胞进行自我更新使得放射破坏的上皮细胞得到修复，但是上皮补偿性增值更新不足导致炎症和黏膜屏障受损，一般在放射治疗2～3周时可出现腹痛、腹泻等胃肠道相关症状［13]。肠道照射剂量和联合同步化疗等因素均影响患者发生放射性肠炎的风险，发生急性肠道毒性的患者发生慢性不良反应的也风险增加［14]。机械屏障是肠道屏障中最为重要的一部分，放射线可损伤肠道黏膜上皮细胞结构完整性，破坏肠道机械屏障，使得肠道组织结构和功能均发生变化。因此，提高上皮细胞增值、维持肠道黏膜完整对于放射性肠道损伤的预防和治疗至关重要。有文献［15]报道，与出现放射性直肠炎症状后用药相比，在照射开始第一天即用中药保留灌肠，可有效推迟放射性直肠炎症状出现时间，减轻放射性直肠炎的症状。

本研究中，预防组小鼠小肠隐窝细胞数、肠绒毛形态及绒毛长度均显著高于照射组，证实该自拟放射性肠炎灌肠液可减轻或修复放射线对肠黏膜层破坏，对小鼠小肠黏膜上皮细胞具有保护和修复作用。而治疗组与照射组无差异，可能由于经照射后，小鼠肠道黏膜已经破坏，灌肠机械操作可能加重对肠道的破坏作用。一项纳入25篇中药保留灌肠与西药保留灌肠治疗放射性直肠炎效果的随机对照试验的meta分析［16]结果显示，与西药(庆大霉素、甲硝唑、利多卡因、地塞米松等)灌肠相比，干预至少14天后，中药灌肠组的临床总有效率显著提高，但干预10天后，2组疗效无差异，作者分析原因可能为干预时间较短，尚未达到药效发挥的时间有关。本研究结果中治疗组对肠道防护效果不优于照射组，可能也有用药时间较短有关。受课题经费等原因，本实验仅进行了肠道机械屏障损伤的防护作用研究，后续还应从肠道微生物屏障、免疫屏障、化学屏障方面对灌肠液的放射损伤防护作用机制进行阐明。

综上所述，自拟放射性肠炎灌肠液预灌肠的急性放射性肠炎小鼠肠道黏膜屏障损伤程度低，发生急性放射性肠炎的小鼠自拟放射性肠炎灌肠液灌肠后肠道黏膜屏障损伤程度减轻。自拟放射性肠炎灌肠液灌肠对急性放射性肠炎小鼠肠道黏膜屏障损伤有预防及治疗作用。放射性直肠炎中医治疗包括中药口服、灌肠，或口服灌肠并用，但以口服与灌肠并用效果最佳［17]，本研究结果采用的是单纯灌肠，在后期临床实践中，可考虑联合应用口服和灌肠液，但对于肠道机械屏障已经严重破坏的患者，不建议灌肠，以免进一步破坏肠道黏膜，可能加重临床症状。