液体活检在肿瘤领域的研究进展

林慧娴 郑磊

1南方医科大学检验与生物技术学院（广州510000）；2南方医科大学南方医院检验科（广州510000）

近年来兴起的液体活检技术克服了传统组织活检的侵入性、取样困难以及难以监测等局限性，使肿瘤的实时动态监测成为可能。液体活检技术主要针对循环肿瘤核酸（circulating tumor DNA，ctDNA）、细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）及循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）等标志物的检测分析，具有非侵入性、重复性强等优势，在肿瘤早期诊断、治疗决策、疗效评估和耐药监测中具有巨大的发展潜力与临床应用前景。此外，液体活检还可反映肿瘤的基因谱，对肿瘤诊治的精准化进程具有推进性意义，因此本文将对上述液体活检的三大检测标志物的生物学特性、主要检测方法以及临床应用进行简要综述，为证明其临床有效性和实用性提供思路，对指导基础实验研究和液体活检的临床实践有重要意义。

1 循环肿瘤DNA（ctDNA）

肿瘤患者外周血游离DNA（cell free DNA，cfDNA）浓度比健康人群高10～100 倍，其中ctDNA 可来源于凋亡或者坏死的肿瘤细胞、CTCs和外泌体。ctDNA 长度约为150～200 bp，其存在形式包括单链DNA、双链DNA 及DNA-蛋白复合体，半衰期为15 min～2 h。虽然ctDNA 仅占全部cfDNA的0.01%～1%，但ctDNA的遗传信息和肿瘤组织有良好一致性，可以动态反映肿瘤基因谱特征。

ctDNA的检测包括浓度变化和结构改变两个方面。因ctDNA 占cfDNA 总量的比例较低，且ctDNA 与体细胞凋亡释放的核酸相比可能仅有一个或数个碱基的微小差别，故对其检测技术灵敏度要求极高。以选择性扩增为核心的技术包括荧光定量PCR、液滴式数字PCR［1］、cold-PCR［2］、ARMS-PCR［3］、高分辨溶解曲线分析技术［4］等，这类方法灵敏度较高，但易发生偏向性扩增，且只可检测已知突变。以测序技术为核心的Sanger 测序（一代）、增强化TAM-测序［5］和CAPP-测序［6］（二代）、纳米孔单分子测序［7］（三代）等方法具有高通量和高效率的优点，但成本相对较高。此外，PCR-流式联合技术［8］、新兴的微球依赖性悬浮点阵法［9］等在提高检测准确性和降低成本方面都有一定的提升。其中微球依赖性悬浮点阵法基于液相芯片技术，灵敏度提高至可检测低至2 μL的样本。

2 细胞外囊泡（EVs）

EVs 是细胞在生理或病理状态下旁分泌的一种膜性囊泡，包括凋亡小体（＞1000 nm）、微囊泡（100～1000 nm）和外泌体（30～100 nm）。EVs 存在于淋巴液、血液、唾液、尿液、脑脊液等体液中，半衰期较ctDNA 与CTCs 长。EVs可将其携带的脂质、蛋白质、核酸、细胞因子等物质运输至特定部位，在细胞信号转导、增殖与分化、炎症反应、肿瘤转移与耐药等方面，发挥重要的作用。

EVs的检测主要包括分离鉴定与内容物分析。分离技术包括差速离心法、密度梯度离心法、尺寸排阻法、微流控法和磁珠分选法等。离心法的优点是对EVs的活性损伤较小，但所需样本量较大且分离纯度较差。尺寸排阻法和微流控技术的分离效率较高，但也存在特异性不足的问题。免疫磁珠分选法具有较好的特异性，但抗原表位的激活可能不利于后续的功能分析。EVs的鉴定包括以电子显微镜法、纳米颗粒跟踪法、动态光散射法为主的物理学鉴定和以蛋白印记法、酶联免疫法为主的免疫学鉴定。物理学方法通过形态和粒径特征对EVs 进行表征，免疫学方法则通过检测特异的表面蛋白标志物对EVs 进行鉴定和亚群分析。EVs 内容物包括蛋白质、核酸、脂质和代谢物，其分析技术主要有质谱法、流式细胞法、液滴式数字PCR法［10］、核磁共振法、表面等离子共振法［11］等。此外，近年来发展迅速的生物传感和电化学传感技术，如电化学“三明治”免疫夹心法［12］、将磁选与电化学检测相结合的手持式iMEX 分析装置［13］以及基于金属纳米颗粒直接电氧化法的多通道金芯片［14］等，均可应用于EVs 检测分析领域。其中多通道金芯片利用特异性适配体修饰不同的金属纳米颗粒，特异性捕获表达多种标志物的目的外泌体与微囊泡。适配体、纳米材料以及电化学传感器的联合运用大大提高了该技术的灵敏度以及检测效率。

3 循环肿瘤细胞（CTCs）

CTCs 是自发或者因诊疗操作而脱离肿瘤原发灶或转移灶进入外周血的肿瘤细胞，半衰期为1～2.4 h。绝大多数CTCs 在短期内被免疫系统杀灭，极少数CTCs 可通过诱导血小板聚集成“物理屏障”逃避免疫杀伤，同时激活血小板释放血管内皮生长因子、TGF-β［15］等调节因子，进而增强其迁移侵袭力并促进新血管形成［16］。虽然CTCs 数量稀少（1～10个CTC/mL），但与肿瘤转移和复发密切相关，是肿瘤预后和监测的潜在标志物。

CTCs 检测包括分离富集和鉴定分析两个方面。CTCs分离富集技术包括以过滤法、密度梯度离心法、微流控法为代表的物理学方法和以CellSearch 法［17］、Anda Test 法［18］、MagSweeper 法［19］为代表的免疫分选方法。物理方法主要依赖细胞大小、密度、电泳特征的差异，具有灵敏性高、漏检率低的优点，但是分离纯度较低，且可能漏检体积较小的CTCs。免疫方法具有较好的分离纯度和特异性，但是受到表面标志物表达异质性的影响，可能导致某些CTCs亚群的漏检。CTC-iChip［20］技术将两种原理有机结合，先根据细胞大小进行分离，然后利用特异性抗体（CKs 或CD45）进行二次富集，提高了检测的捕获率与准确性。此外，纳米材料和适配体体系［21］、声学原理［22］等也开始应用于CTCs 检测领域，端粒酶活性［23］、体内捕获策略［24］等逐渐成为新型检测平台研发的切入点，有望使CTCs 富集准确性得到质的飞跃。CTCs 鉴定及下游分析技术包括免疫细胞化学法、流式细胞术、荧光定量PCR、FISH技术、二代测序技术等，可结合细胞形态和肿瘤标志物对CTCs 进行鉴定、形态/功能亚群分析以及治疗/耐药靶点检测。

4 液体活检在肿瘤领域的临床应用

4.1 辅助临床诊断和分期传统影像学检查未能发现病灶时，外周血中已存在ctDNA、EVs和CTCs，早期检测这些标志物有助于肿瘤的诊断。ctDNA 异常甲基化检测已进入结直肠癌、肺癌、胰腺癌等肿瘤筛查和诊断的临床实践。例如p16INK4A 启动子［25］、SHOX2和PTGER4等基因［26］异常甲基化均可辅助肺癌的诊断。关于EVs，研究发现肺癌患者的miR-21［27］、结直肠癌患者的CRNDE-h［28］表达水平显著升高，提示EVs 可成为肿瘤的早期诊断标志物。据报道，外泌体源性LINC00152和lncRNA-CRNDE-h 在胃癌和结直肠癌早期诊断中优势突出。此外，研究表明CTCs 与乳腺癌［29］、非小细胞肺癌［30］、结肠癌［31］等临床分期的关系密切。除了数量的差异，CTCs的分子特征在肿瘤分期中也具有指示作用，CTCs 中ga733.2、muc-1，、mgb1、spdef 基因表达水平与乳腺癌分期显著相关［32］。

4.2 辅助进行疗效评估以及耐药性监测液体活检在耐药性检测及疗效评估中的应用引起了广泛关注。通过检测ctDNA的变化如乳腺癌患者HER2的异常扩增［33］，非小细胞肺癌患者T790M 突变［34］等可预测肿瘤耐药。外泌体在肿瘤耐药性的产生与传递中发挥重要的作用。胰腺癌患者外泌体分泌增多，可促进吉西他滨耐药性的产生［35］。耐药患者与敏感患者的外泌体蛋白表达也存在差异，例如卵巢癌铂类药物耐药患者的外泌体annexin A3 表达水平明显高于敏感组［36］。因此，外泌体可作为指示耐药和评估疗效的标志物，且抑制特异性外泌体的释放可能可逆转耐药性的产生，亦可为突破肿瘤治疗的耐药性瓶颈提供新的方向。CTCs的数量及分子特征也可提示治疗效果和耐药。CTCs 根据其分子特征可分为不同的亚群，如肿瘤干细胞样、EMT 样和转移起始样CTCs等，其中根据EMT的程度又可分为上皮型、间质型、混合型亚群。有研究发现CTCs的EMT 可作为乳腺癌耐药标志物［37］，间质型CTCs 比例减少提示治疗有效，反之与疾病进展相关。因此，CTCs亚群分析有助于制定个体化、有效化、靶向化的治疗方案，进一步推进肿瘤精准诊治。此外，对分离出的CTCs 进行体外培养，有利于药物敏感性机制的研究，开发相应的靶向药物。

4.3 实时监测肿瘤的发展状况和预后判断传统的组织活检重复取样受限，难以实现动态监测，因此临床上治疗方案的调整与预后评估困难重重。液体活检在规避上述局限性的同时，还可综合肿瘤异质性因素对疾病进展进行监测，并且为揭示肿瘤转移机制提供依据。有研究［38］发现肝癌患者不同血管部位的CTCs 分布与生物学特征例如EMT 状态存在明显的空间异质性，对肝癌多血管CTCs 检测有助于揭示其转移的新机制以及预测其转移模式。ctDNA 特征分析可溯源肿瘤的发生部位［39］，从而为肿瘤原发灶和转移灶的判断提供信息。此外，ctDNA的遗传信息和肿瘤组织有良好的一致性，可作为肿瘤复发监测和预后评估的标志物。例如，ctDNA的BRAF 突变水平可作为黑色素瘤患者生存的一项预测因素［40］。另一方面，EVs 尤其是外泌体，在预后评估中也展现了极大的应用价值。EVANS等［41］指出放化疗中Annexin 阳性外泌体含量和胶质母细胞瘤的早期复发与总生存期相关。乳汁外泌体TGFβ2 水平分析有助于乳腺癌进展的评估［42］。此外，大量研究表明，CTCs 是早期乳腺癌［43］、胃癌［44］、非小细胞肺癌［45］等患者的独立预后因素。

4.4 肿瘤的靶向治疗近年来，针对免疫检查点抑制剂、血管形成和关键信号通路的肿瘤靶向疗法逐渐成为热点问题。ctDNA 肿瘤突变负荷、EVs 内容物图谱、以及CTCs数量与分子表征在靶向疗法群体筛选和治疗方案调整中均有指示作用。Lentz 提出全血经膜滤过法［46］可减少外泌体，使部分患者的肿瘤缩小了50%以上。利用肿瘤抗原刺激自体树突细胞，产生EVs，激活相应抗肿瘤免疫活性，可使患者病情减缓［47］。EVs 内容物也可作为有效的肿瘤靶向抑制剂，且EVs 是机体天然的内源性物质，且有较好的膜稳定性和靶向性，可作为良好的药物传递载体。研究表明，针对耐药性肺癌，外泌体包裹紫杉醇后药效可提高至紫杉醇直接给药的50 倍［48］。尽管尚有许多挑战亟待解决，EVs 在靶向载药和肿瘤免疫治疗方面仍展现出巨大的发展潜力。

5 总结与展望

液体活检作为一种非侵入性的新型检测技术，具有取样方便、可动态监测等优势。针对液体活检标志物ctDNA、EVs和CTCs的检测分析，在肿瘤的早期诊断、耐药监测、疗效评估、预后判断中具有重要的临床应用价值。但是，液体活检技术也存在一些亟待解决的问题。一方面，ctDNA、EVs和CTCs的检测技术缺乏规范化的流程和质量控制标准，尚未有统一的临床参考值。另一方面，如何在提高检测特异性、灵敏性、经济性之间取得平衡仍值得考量。目前，大多数检测都只聚焦于一种分析物，而综合多种血液分析物的多参数检测可能可以大幅度改善检测的精确度和使用范围。基于检测技术、基础生物学、分子生物学等多学科发展将是液体活检未来的方向，需要我们深入了解液体分析物的产生机理和动态变化，确认液体标志物的临床有效性和实用性，进而推动液体活检在肿瘤临床诊疗中的广泛应用。