长链非编码RNA在乳腺癌中的表达研究进展

刘孟雨，钱 军

乳腺癌是女性最常见的癌症之一，同时也是导致女性因癌死亡的一个主要原因。随着早期发现的普及和手术治疗、放化疗、内分泌治疗、分子靶向药物等综合治疗的开展，乳腺癌患者病死率有所下降，但乳腺癌的复发仍不可避免。因此探究乳腺癌的发生发展过程具有重要意义。该文对lncRNA在乳腺癌的发展、侵袭转移、治疗耐药及作为标志物等方面进行系统综述，以期为乳腺癌的诊疗提供新的方向。

1 长链非编码RNA（lncRNA）概述

约98%的 “垃圾”DNA转录为非编码RNA（ncRNAs）［1］， 非编码 RNA 家族中的一个重要的成员—长链非编码RNA（lncRNA），它的转录长度超过200个核苷酸且它不编码蛋白质。根据其基因组位置可分为五类：正义lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、内含子 lncRNA 和基因间 lncRNA［2］。 近年来越来越多研究发现lncRNA在很多生物学进程中扮演者重要的作用。lncRNA的基因调控可以在不同的水平上发挥作用，包括染色质修饰、转录、转录后处理、mRNA的支架或诱导以及转录后信使RNA的调控［3］。尽管lncRNA研究相对较少，lncRNA的临床应用是一个新兴的热门领域，其作为诊断标志物和治疗靶点具有广泛的前景［4］。

2 促进乳腺癌发展的LncRNA

2.1 LSINCT5 LSINCT5是一种长约2.6 kb的LncRNA，一般位于细胞核内，其基因由RNA聚合酶Ⅲ而不是 RNA 聚合酶Ⅱ转录［5，6］。 LSINCT5 在乳腺癌细胞中过表达，在乳腺癌组织中也过表达。如果将LSINCT5基因敲除，乳腺癌细胞的增殖将减少［6］。因此深度研究LSINCT5并抑制其表达可能将会为乳腺癌的诊治带来新的方式。

2.2 LncRNA-Smad7 在小鼠中，LncRNA-Smad7位于Smad7基因的附近，LncRNA-Smad7在乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞中的表达抑制了癌细胞的凋亡［7］。TGF-β的抗凋亡作用可能与抑制LncRNA-Smad7的表达有关。相反，异常表达的LncRNASmad7可以对抗TGF-β受体抑制剂诱导的细胞凋亡。LncRNA-Smad7可能仅通过影响细胞凋亡而促使乳腺癌的发生，因为其表达的缺失对TGF-β诱导的上皮-间质-细胞转化、Smad2磷酸化或Smad7的表达没有影响。这表明LncRNA-Smad7是乳腺癌的启动子，但不同于其他启动子，它只能抑制细胞凋亡，LncRNA-Smad7有待进一步研究。

2.3 NEAT1 NEAT1基因编码两种LncRNA亚型，在核旁斑中起重要作用，对RNA的剪接和转录起调节作用。NEAT1在包括乳腺癌在内的多种癌症中作为致癌因子发挥作用，其表达受ERα信号转导、 miR-449b-5p/c-Met轴和缺氧反应的调节［8］。 研究表明LncRNA NEAT1促进肿瘤的进展。NEAT1通过诱导上皮-间充质转变（EMT）促进肿瘤侵袭。LncRNA NEAT1可作为乳腺癌新的诊断标志物和治疗靶点［9］。 研究显示［10］，高 NEAT1 表达水平组与低NEAT1表达水平组间OS存在显著性差异。NEAT1高表达组的OS明显低于NEAT1低表达组。因此说明NEAT1表达水平的升高与OS降低有关。但是，由于该研究具有局限性，可能需要更大样本量、多中心和更高质量的研究，以确定较高的NEAT1表达水平和较低的NEAT1表达水平，以进一步确认本研究的发现。

2.4 BANCR LncRNA BRAF调节的LncRNA 1（BANCR）在乳腺癌中的作用尚未阐明。研究发现，BANCR在乳腺癌细胞和组织中过表达，可促进疾病的临床进展，包括肿瘤大小、淋巴结转移。BANCR过表达可促进乳腺癌的临床进展、转移和增殖，提示乳腺癌患者预后不良。因此，BANCR可能是乳腺癌患者的潜在预后标志物和治疗靶点［11］。BRAF激活的非蛋白编码RNA（BANCR）是一种新的潜在的肿瘤细胞增殖和迁移的调节因子［12］。LncRNA BANCR在乳腺癌中高表达，与患者的预后密切相关。BANCR的下调可抑制MCF-7细胞的增殖、侵袭和转移能力［13］。

2.5 SNHG12 LncRNA SNHG12已被证明在多种人类癌症中发挥作用［14］。SNHG12在乳腺癌中的表达机制尚不清楚。SNHG12在三阴性乳癌癌中表达上调，其高表达与肿瘤大小和淋巴结转移密切相关。机制研究表明，SNHG12是C-MYC的直接转录靶点。SNHG12可能会引起三阴性乳腺癌的发生［15］，三阴性乳腺癌治疗效果仍不理想，所以SNHG12可能是一个很有前景的治疗靶点。

3 抑制乳腺癌发展的LncRNA

3.1 NKILA 最近，有研究［16］报道了一种新的Lnc-RNA（NKILA）。 在 NF-κB 上调下，NKILA 与 NF-κB/IκB结合生成稳定的复合物，从而直接覆盖IκB的磷酸化结构域。NKILA可以防止炎症刺激下乳腺上皮细胞中NF-κB的过度激活。在MDA-MB-231（即乳腺癌细胞系）中，NKILA可增强细胞凋亡，减少侵袭。NKILA可能通过抑制NF-κB的活化来阻止乳腺癌的侵袭和转移。由此可以推断一些LncRNA抑制乳腺癌的发生和发展。就机制而言，它主要通过抑制乳腺癌细胞增殖、促进乳腺癌细胞凋亡、抑制细胞的侵袭和转移来抑制乳腺的发生和发展。

3.2 ZFAS1 研究表明，位于乳腺导管和腺泡内的Zfas1在妊娠和哺乳期间表达不同，这与乳腺发育有关。从乳腺上皮细胞中敲除Zfas1后，细胞增殖增强。研究［17］发现Zfas1在乳腺癌组织中的表达低于正常乳腺组织。因此，Zfas1是乳腺癌的强效抑制剂。其在乳腺癌起源中的作用和机制有待进一步研究。

3.3 GAS5 GAS5是另一种可能导致细胞生长停滞和凋亡的LncRNA。与乳腺正常细胞相比，GAS5在乳腺细胞中显著下调。研究显示［18］过表达GAS5可增加MCF10A和MCF7（乳腺癌细胞系）在紫外线照射和顺铂作为抗癌药物的干预下的细胞凋亡率。在某些情况下，乳腺癌细胞系的生长停滞和凋亡可能是由异常表达GAS5引起的。此外，在缺乏营养物质或生长因子诱导的生长停滞的细胞中，GAS5的表达较高，这些细胞对促进细胞凋亡的刺激极为敏感［19］。因此，一些LncRNA可能通过抑制细胞增殖和刺激凋亡来抑制乳腺癌的发生发展。这些LncRNA有望用于参与乳腺癌的干预。

4 LncRNA与乳腺癌治疗耐药

尿路上皮癌相关基因1（UCA1）参与三苯氧胺耐药，其异常表达与膀胱癌［20］、胃癌［21］、大肠癌［22］和乳腺癌［23］等多种癌症的耐药有关。长链非编码RNA-UCA1位于染色体19p13.12中，具有调控细胞增殖、凋亡、侵袭、细胞周期和耐药等多种功能［24，25］。用RT-PCR方法检测了54例Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌组织中UCA1的表达，结果显示UCA1在晚期（Ⅲ～Ⅳ）有较高的表达。在相同的样品中，使用免疫组织化学方法，在细胞核中也观察到较高的β-链蛋白表达。用异种移植小鼠的肿瘤组织证实了这一发现，当UCA1被过度调节时，通过Western印迹观察到较高的β-链蛋白表达。此外，使用UCA1敲除的体外分析显示细胞存活和迁移能力降低，并促进三苯氧胺耐药乳腺癌细胞的凋亡。这些发现表明UCA1的表达通过刺激WNT/β-链蛋白信号转导途径增强三苯氧胺的耐药性，从而允许ER的细胞外再分布，因此，抑制WNT途径或UCA1的表达或可降低三苯氧胺的耐药性［23］。AKT/mTOR细胞信号通路也参与了UCA1激活的三苯氧胺耐药途径。通过免疫印迹法检测LCC2与LCC9（三苯氧胺耐药乳腺癌细胞）和MCF-7（三苯氧胺敏感乳腺癌细胞系）中的p-AKT和m-TOR，证实了这一发现。研究者观察到UCA1在LCC2和LCC9细胞中同时过表达，P-AKT和P-MTOR的表达显著增加。相反，UCA1沉默显著降低了LCC2和LCC9细胞中P-AKT和PMTOR的表达。这些结果提示UCA1正向调节AKT/mTOR信号通路，导致三苯氧胺耐药性的增加［26］。UCA1似乎也与曲妥珠单抗耐药有关。在抗曲妥珠单抗乳腺癌细胞株SK-BR-3中，siR-NA使该基因沉默，导致曲妥珠单抗诱导的细胞凋亡增加，miR-18a表达上调。这表明，在曲妥珠单抗耐药细胞中，UCA1上调，miR-18a靶向YAP1（一个与PI3K和MAPK信号转导上调相关的关键蛋白），允许其过表达。然后，需要UCA1/miR-18a/YAP1轴的作用来验证体内HER2+乳腺癌的模型［27］。迄今为止，lncRNA在抗曲妥珠单抗中的作用尚有待阐明，需要进一步研究以了解其潜在的用途。

Linc-ROR（也称为 lincRNA-ST8SIA3）在乳腺癌组织中显著上调，可诱导MDA-MB231细胞EMT表型和EMT标记波形蛋白和神经钙黏蛋白的表达。通过过表达和shRNA介导敲除实验，研究者证实，linc-ROR既增强了这些细胞的侵袭能力，又降低了它们对紫杉醇的敏感性［28］。

lncRNA（MAPT-AS1）是 MAPT基因的反义转录本，反义转录本又编码TAU蛋白；该蛋白与紫杉醇竞争微管结合，使细胞对其作用产生抗性。研究发现MAPT-AS1在ER阴性乳腺癌中与紫杉醇抗性有关。他们观察到MAPT-AS1表达也与MAPT表达相关。结果证明其潜在的机制：MAPT-AS1结合MAPT转录本并稳定它，从而有助于高TAU水平［29］。

5 LncRNA与乳腺癌侵袭与转移

5.1 HOTAIR 研究［30］发现 HOTAIR（LncRNA 的一种）在原发性乳腺癌组织中的表达与正常乳腺组织相比有不同程度的增加，而在转移性乳腺癌中HOTAIR的表达上调达数倍，甚至近2000倍。然而，它在原发肿瘤中的表达并没有那么高。在原发性乳腺癌组织中，HOTAIR的高表达可作为肿瘤转移和患者生存的标志［31］。此外，高表达的HOTAIR可能增强乳腺癌细胞的侵袭。体内实验发现HOTAIR的高表达可促进肿瘤的生长和发生肺转移。敲除HOTAIR基因可显著降低乳腺癌细胞的侵袭性。就其机制而言，已发现高表达的HOTAIR可诱导PRC2（一种转录抑制剂）和H3K27me3在854个基因位点上结合，这些基因大多被HOTAIR抑制。HOTAIR已被报道为多种恶性肿瘤的生物标志物，但其参与乳腺癌的机制尚不完全清楚。研究表明，乳腺癌细胞中HOTAIR和EZH2的表达较高。此外，HOTAIR的下调或EZH2的沉默可抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，同时促进其凋亡［32］。

5.2 linc-ROR 研究［33］发现 linc-ROR在乳腺癌组织中表达上调，在人乳腺上皮细胞中异常过度表达的linc-ROR诱导了上皮-间实质转变 （EMT）过程。此外，他们还发现linc-ROR能促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。这些结果表明，linc-ROR是EMT的重要调节因子，通过调节小RNA分子促进乳腺癌的进展和转移。另外，相关研究发现linc-ROR作为侵袭性和转移性乳腺癌的治疗靶点的相关性。

6 LncRNA用作生物标志物

6.1 LncRNA用作诊断标志物 研究［34］发现了LncRNA可能在诊断乳腺癌中的得到应用。他们发现，与正常乳腺组织相比，在乳腺癌标本中，lincRNA-BC2和lincRNA-BC5通常上调两次以上，而lincRNA-BC4和lincRNA-BC5则下调。在乳腺>癌3期，lincRNA-BC4的表达显著降低，而lincRNABC5的表达显著升高，并且lincRNA-BC2的表达与淋巴结转移呈显著正相关。特别发现许多LncRNA的表达与不同的分子分型高度相关［35］。此外，一些研究表明血清中的LncRNA可用于乳腺癌的诊断。例如，在乳腺癌患者血清中RP11-445H22.4的表达显著增加。研究者［36］旨在根据LncRNA的表达特征研究预测对三苯氧胺的反应。根据这个特征，雌激素受体阳性乳腺癌患者可以分为高危和低危组。在三苯氧胺治疗的高危患者的诊断中，LncRNA特征可能具有临床意义。因此，某些LncRNA或可用作乳腺癌的诊断标志物。

6.2 LncRNA用作预后标志物 研究［37］发现了一系列LncRNA，可用于区分乳腺癌患者低风险与高风险。LINC00324的高表达与PTPRG-AS1的低表达与长生存期有关。另一项研究表明SPRY4-IT1通过上调ZNF703的表达促进乳腺癌细胞增殖。此外，SPRY4-IT1表达增加与乳腺癌患者较大的肿瘤和较晚的病理分期有关［38］。 因此，SPRY4-IT1是一种新的预后标志物和潜在的治疗靶点。HOTAIR在乳腺癌组织中的高表达与较高的侵袭性和转移有关，提示HOTAIR可能成为预测乳腺癌整体生存期的预后标志物。HOTAIR的表达可独立预测ER阳性乳腺癌是否转移。此外，LINC00472在乳腺癌组织中的高表达与乳腺癌细胞侵袭性差和治疗效果较好有关［39］。相关临床和体内研究提示，LINC00472是一种肿瘤抑制剂，在临床中对判断预后和预测乳腺癌的治疗效果可能存在价值。MALAT1是一种高度保守的LncRNA，在包括乳腺癌在内的多种癌症中高度表达。体内外研究表明MALAT1可促进三阴性乳腺癌的增殖、发展和转移。最近一项利用MALAT1反义核苷酸进行基因干预的研究在乳腺癌Luminal-B型小鼠模型中取得了良好的抑制肿瘤发展的效果。这些研究表明MALAT1有望成为乳腺癌预后的新的生物标志物和治疗乳腺癌的潜在靶点［40］。

6.3 LncRNA用作预测乳腺癌耐药和生存的标志物 LncRNA作为预测乳腺癌耐药和生存的标志物，具有潜在的应用价值。LncRNA BCAR4的过表达对预测雌激素类药物三苯氧胺的耐药性是有效的。另一方面，与ER阴性的乳腺癌和正常组织相比，LINC00160和LINC01016在ER阳性乳腺癌中高度表达，这与Luminal-A型乳腺癌患者的整体存活率呈显著负相关［41］。特殊的乳腺癌亚型可以通过检测CCAT2是否过度表达，对环磷酰胺辅助化疗反应差来鉴定［42］。 最后，有研究［43］表明 LncRNAROR的过度表达与化疗耐药性有关，提示ROR可作为预测化疗耐药的指标。从以上结果可以推断，某些LncRNA可能成为预测乳腺癌耐药和生存的标志物。因此，研究者们正在基于对LncRNA的现有认识，从多个角度（主要包括乳腺癌的诊断、预后判断、耐药预测和生存期）探索LncRNA的应用。虽然还需要一些时间来将它们付诸实践，但相信随着相关研究的深入和广度的提高，它们的应用将会更多。

综上所述，近年来，关于lncRNA在肿瘤中的作用的研究越来越得到重视，有些lncRNA的功能及作用机制有了明确的认识，但对大多数的lncRNA的认识还处于起步阶段。不同物种间lncRNA保守序列较少，物种间序列差异较大，这使得动物实验开展比较困难，这进一步加大了lncRNA的研究难度。可喜的是，随着基因阵列技术和高通量测序技术的发展等研究方法的不断完善，我们有望发现更多种类的lncRNA，这将会推动lncRNA的研究发展。我们相信，随着人类对lncRNA研究的深入，lncRNA会对揭示乳腺癌发生发展的机制做出重要的贡献，有些lncRNA会成为乳腺癌的诊断、系统治疗耐药、判断预后的生物标志物。