HIV的实验室检测方法研究进展

臧 旭

获得性免疫缺陷综合征（艾滋病）是目前由HIV病毒引起的最具破坏性的疾病之一，传染性强，病死率高。从全球范围来看，非洲区域病情最严重，仅2017年艾滋病毒新发感染数占全球的近2/3。我国自1985年发现第一例艾滋病患者以来，艾滋病患者不断增多。2010年—2016年，中国艾滋病发病数和死亡人数总体呈上升趋势。2017年全国艾滋病发病数已达57 194例，是2010年全年发病数的近3倍［1］。

研究表明，从灵长类慢病毒到人类的HIV的跨物种传播，病毒可以在系统发育上分为两类；HIV-1和HIV-2［2］。这种区别对于准确监测和诊断以及在人群中施用适当的抗反转录病毒疗法至关重要，目前艾滋病毒1型（HIV-1）是人类反转录病毒中的第一种，占世界艾滋病毒感染的95%以上［3］。艾滋病病毒在人体内的平均潜伏期为8～9年，患者无任何症状，外表与常人无异，但是由于HIV病毒主要攻击的是人体的免疫系统，一旦侵入机体细胞，病毒将会和细胞整合在一起终生难以消除，T4淋巴组织受损导致人体最终因合并感染各种疾病甚至死亡［4］。HIV病毒广泛存在于感染者的血液、精液、阴道分泌物、乳汁、脑脊液、有神经症状的脑组织液中，其中以血液、精液、阴道分泌物中浓度最高［5］，最主要的传播方式也是通过传播以上几种物质产生，如性传播、血液传播和母婴传播［6］。由于艾滋病病毒的高致病性及传染性，早期对疑似感染者的检测就显得尤为重要。目前检测HIV感染者体液中病毒抗原和抗体的方法，操作方便，易于普及应用，其中抗体检测尤为普遍［7］。但HIV P24抗原和病毒基因的测定，在HIV感染检测中的地位和重要性也日益受到重视［8］。该文就近年来HIV实验室检测的研究进展和发展趋势综述如下。

1 抗体检测

1.1 初筛实验 血清中HIV抗体是判断HIV感染的间接指标。根据其主要的适用范围，可将现有HIV抗体检测方法分为筛检试验和确证试验。初筛主要包括酶联免疫吸附测定（ELISA），凝胶颗粒凝集试验，乳胶凝集试验，放射免疫试验和各种快速检测试验等［9］。ELISA可使用血液、唾液、尿液样品将已知的抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗体反应在固相表面进行的技术。其中ELISA是目前进行HIV抗体初筛最有效也是最常用的检测手段，目前ELISA的试剂已开发到第4代［10］。第1代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板，由于含有宿主细胞成分的污染和杂蛋白的存在，故假阳性较高。目前国内外主要使用第3代（双抗原夹心法）试剂。血液样品的筛查仍以第3代ELISA为主，国际上有些国家和地区已将第4代ELISA试剂用于血源筛查，目前第4代ELISA试剂可同时检测p24抗原和HIV-1/2抗体［11］。吴忠华等对目前市售的三种进口第4代试剂盒进行性能评价，发现所用的第4代试剂敏感性均高于第3代检测试剂［12］。与第3代试剂相比，第4代试剂检测窗口期大约平均缩短4～5 d［13］。第1代到第 4代的ELISA检测方法对比研究结果发现，ELISA试验适合用于大批量标本的检测，而第3代ELISA更适用于目前的临床检测条件，因其具有较高的特异性和敏感性［14］。由于ELISA检测依赖于化学发光和时间分辨荧光免疫分析技术等方法，其灵敏度较低，并且第4代试剂的成本更高，所以若全面取代第3代检测试剂，还需要进一步研究和考证。

由于HIV的高危险性，对于检测试剂和手段的需求不仅包括高特异性和灵敏度，同时也要求更加方便快捷准确，所以进行HIV的快速检测试验（RT），能够在 10～30 min内得到结果，可用于急诊检测。包括凝胶颗粒凝集试验（PA），它是通过包被HIV抗原的颗粒凝集来检测抗体的存在，根据其凝集反应判断结果；免疫斑点试验，通过使用硝酸纤维膜作为固相载体，将HIV固定在其膜上，加入样品后阳性结果将以有色斑点的形式出现在膜上抗原部位；免疫层析试验，以硝酸纤维膜为载体将HIV抗原固定在膜上，加入待测样品后由于层析作用复合物沿着固相载体迁移，阳性结果以红色条带的形式产生，由于该方法灵敏度不及ELISA试验但是试剂可以常温保存并且步骤简单快速，所以适用于基层实验室筛查［15］。 张宏萍［16］对三种 HIV 的筛查方法进行比较，即，酶联免疫吸附试验（ELISA）、明胶颗粒凝集试验（PA）和免疫斑点试验，对于初筛阳性标本都没有漏检现象，检出率敏感性均为100%；PA法检测时不需要任何仪器但是相对检测时间较长，免疫斑点试验试剂稳定操作简便且特异性高于ELISA和PA法。刘福荣［17］对RT法与ELISA法进行比较，结果发现ELISA假阳性率为80%（40/50），RT法为23.5%（4/17）RT法测定HIV结果的假阳性率低于ELISA法，RT的特异性高于ELISA试验。

1.2 抗体确证实验 由于HIV检测需要高度的准确性所以初筛并不能保证较高的特异性，还需要进一步的确证实验，包括免疫印迹试验（WB）、条带免疫试验、放射免疫沉淀试验（RIPA）及免疫荧光试验（IFA）等。目前实验室诊断HIV最常用的确证方法是免疫印迹试验（WB），由于其灵敏度和特异度较高也是《全国艾滋病检测技术规范2009版》中首选的确认方法［9］。免疫印记法是将HIV裂解成不同的片段，在凝胶电泳过程中，病毒不同蛋白按分子量的大小顺序排列，并转移到硝酸纤维素膜上，进行特异性抗体孵育后与酶标二抗共同显色，根据其出现两条以上的条带则能够判定HIV阳性［18］。由于WB法实验操作步骤较多，对技术要求高可控性不理想，所以作为HIV的首选确证方法仍需要进一步研究。在进行筛查试验与WB试验间的关系研究中显示，HIV抗体复核的468例样本中，两种ELISA检测方法均呈阳性反应的464例，与WB符合率99.13%，所有的确证样本中，HIV-1抗体特异带的gp160、gp120、gp41、p24 的出现都在 98.00%以上，研究证明ELISA初筛实验存在一定假阳性结果，最终判断还需以确证实验结果为准［19］。但是即使WB作为应用最广泛的确证方法也存在漏检风险［20］，有学者研究发现WB法存在一定错误判断，将仅有包膜蛋白（gp41+gp20/gp160）或 gag+包膜（p24+gp41或gp120/gp160）的部分人群判断为HIV阳性，假阳性率甚至达到8%［21］。所以目前针对WB检测可能出现漏检的问题，多通过初筛4代阳性+3代阳性样本，WB确证阳性判别HIV感染患者，若4代阳性+3代阴性样本，WB检测存在漏检问题，需要补充核酸试验确定［22］。 王佑春［23］对于确证试验的几种方法进行了比较研究，发现IFA试验的特异性和敏感性比ELISA试验更好，并且与WB相比更易操作，IFA法可以作为WB试验的简单替代法。

2 HIV抗原检测

p24抗原是HIV-1的核心蛋白，在HIV入侵人体后p24的发生水平能够随病毒的复制而发展，所以HIV-1 p24抗原能够在患者早期样本中检测出来，检测时间早于HIV抗体，因此将p24抗原的检测用于早期感染，目的缩短窗口期［24］。p24能够在感染后约2～3周内检出，但随着抗体的中和作用，游离性抗原减少，此时对于抗原检测会出现一定程度的影响，机体此时进入无症状感染期。疾病后期p24抗原水平会随着病毒的复制再次增强，所以p24抗原检测可以作为HIV的早期诊断方法，监测其浓度变化可以反映病情进展［25］。对于HIV-1 p24的抗原检测主要有ELISA、放射免疫分析、IFA等技术。通常ELISA法是检测p24抗原的有效手段，但是也存在假阳性可能，所以需要进一步确证实验。杨晓亮等［26］将使用第4代增加了P24抗原检测系统的ELISA与胶体硒法、WB法的检测结果进行比较，结果发现第4代ELISA试剂检测、胶体硒检测及WB检测HIV的阳性率分别为0.34%、0.29%及0.27%。第4代ELISA的HIV漏检率（1.3%）低于胶体硒法（4.9%），而其检测HIV的假阳性率（0.03%）高于胶体硒试剂（0.01%）。近年来，随着科学技术的不断突破，针对抗原检测的新方法也在应用当中，如免疫复合物裂解检测法（ICD）、超敏感酶免疫测定法（UEI）、免疫吸附电镜法（ISEM）、线性免疫酶测定（LIA）、荧光联结抗原定量法（FLAQ）［27］。 有研究显示，免疫复合物裂解检测法目前的敏感性已提高到90%［18］。虽然p24抗原检测方法的灵敏度得到大幅提高但是还不能代替RNA病毒的测定，还需要进一步的研发。

3 HIV核酸检测

核酸检测是目前最敏感的HIV检测手段，其测定方法大致上分为反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、分支DNA 信号放大系统（bDNA）、核酸序列依赖性扩增（NASBA）和连接酶酶促链式反应（LCx）4种。目前临床上应用的自动PCR检测系统能够将PCR扩增过程和检测限值在单个反应管中进行，避免了实验过程中的污染［9］。 杨成勇等［21］使用病毒核酸载量法和HIV-1 RNA的巢式反转录PCR（nested RTPCR）法与WB方法进行对比，研究结果发现该研究表明对只有 gp160、p24 和 gp160、gp120、p66、p24 的特殊阳性标本和以p24为主的抗体不确定标本需要用RT-PCR或NASBA方法进行核酸检测，以进一步确认。在不确定标本的鉴定方面，缪礼锋等［28］将核酸定量方法与血清学方法进行比较，结果发现针对env带的不确定标本预示有较大的感染风险，尤其是gp160、gp120和gp160、p24两种带型，须做进一步的随访和鉴别诊断；应当视情况采用核酸方法鉴别诊断；病毒载量检测是鉴别不确定标本的有效方法。核酸检测技术能够进行定性定量的检测，并且特异性强、灵敏度高，但由于所需的试剂、仪器昂贵，费用高，真正运用到常规检验工作中存在一定难度。

4 耐药性检测

世界在抗击艾滋病方面取得了重大进展——在过去的40年里，艾滋病已经夺走了3500万人的生命。随着越来越多的人获得拯救生命的治疗，每年的死亡人数都在急剧下降。但也遇到了一些挫折，最明显的就是耐药性的增强［29］。HIV-1遗传变异是HIV-1反转录酶（RT）高速率复制发生错误的结果，耐药菌株的产生是由于病毒复制过程中的不完全抑制治疗，几乎临床上所有的耐药菌株均来自于药物的选择压力［30］。HIV耐药性的检测分为：基因型检测法，通过DNA序列检测耐药性点突变；表型检测法，通过检测病毒在多种抗反转录病毒药浓度中的生长能力判断是目前耐药性检测的金标准。李晶等［31］对HIV-1耐药性基因检测法在临床应用中进行评价，结果显示对HIV-1耐药性基因型检测法能有效地监测感染者血浆中耐药性病毒株的存在，该方法提供的结果准确、可靠。就目前我国临床治疗现状，王露等［32］发现我国应用抗反转录病毒治疗的患者中耐药性的产生已经十分严重，尤其是针对NNRTIs的高度耐药性较为突出，迫切需要应用耐药性检测进行指导。

综上所述，目前，中国的艾滋病疫情呈现几个显著特点：一是艾滋病疫情上升幅度进一步减缓，艾滋病综合防治效果开始显现；二是性传播持续成为主要传播途径，同性间的传播，上升速度明显；三是全国艾滋病总体呈低流行态势，部分地区疫情严重；四是全国艾滋病受影响人群增多，流行模式多样化。由于时间和成本的限制，在我国有些医疗点或资源有限的环境中进行艾滋病毒诊断会带来相当大的挑战。对HIV的检测，灵敏度及特异度高的分析方法将有助于HIV的早期诊断，避免漏检，目前，基于核酸的测试是诊断感染后窗口期和血清转化前最近感染的唯一可靠方法，但这些测试仅适用于装备精良的实验室环境。对于更方便快捷，经济性准确性更高的实验室检测方法还需要进一步研究开发。