Fstl1-TGF-β1-Smad2/3信号通路与肺纤维化的靶向治疗

杨 华，张莉莉

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）是以上皮细胞受损、成纤维细胞增殖活化、细胞外基质聚积、肺泡不可逆性破坏为主要特点的肺间质性疾病（interstitial lung diseases，ILDs）， 是多种间质性肺病的终末期改变。在纤维化肺疾病中，继发于结缔组织病的肺纤维化 （connective tissue diseaseassociated interstitial disease，CTD-ILD） 常常以组织病理学的不同类型为特征，不同的病理类型对药物的反应不一，而特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是临床较为常见的疾病，病因未明，具有渐进性和致死性。两类肺纤维化具有异质性，又有共同的致纤维化途径［1］。肺纤维化常见症状有咳嗽、进行性呼吸困难、乏力等，晚期多因呼吸衰竭而死亡，半数可伴杵状指和发绀。由于肺纤维化预后差，致残率和致死率高，药物疗效有限，严重威胁患者的生活质量和生存率，成为近年来诊治的难点而备受关注。

目前IPF病因和发病机制都不很清楚，可能与环境（如接触金属和木粉）、吸烟、药物、遗传、病毒感染等因素相关。新近一项研究报告显示，美国IPF 的患病率是（14.0～42.7）/10 万人口［2］，但我国缺乏相应的流行病学数据，中华医学会呼吸病学分会根据国内十几家综合医院就诊资料发现，近10年我国住院的IPF患者的比例呈明显的上升趋势。由于IPF预后较差，发病率及病死率呈逐年增加的趋势，根据欧洲10个国家统计机构提供的1999年—2012年间的IPF死亡率，年龄标准化死亡率为4～10/10万人口，且与年龄呈正相关，男性多发［3］。IPF久治不愈的主要原因是对IPF发病机制缺乏正确的认识，因而缺少特异性的高效治疗药物及措施。早先免疫抑制剂被认为是IPF的重要治疗手段，糖皮质激素联合硫唑嘌呤或环磷酰胺甚至效果更优，但2015年更新的ATS/ERS/JRS/ALAT临床实践指南明确不推荐强的松+硫唑嘌呤+N-乙酰半胱氨酸，同时不推荐使用的还有抗凝剂华法林、选择性内皮素受体拮抗剂安倍生坦、单靶位酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼，有条件地推荐使用多靶位酪氨酸激酶抑制剂尼达尼布、吡菲尼酮、抗酸治疗［4］。氧疗只是一种对症的手段，不能从根本上治愈肺纤维化；而肺移植在我国面临供体稀缺的问题，能接受肺移植的患者极少；目前临床各种药物只是延缓肺纤维化的进程，并不能阻止或逆转肺纤维化的发展。

近年来，随着对肺纤维化发病机制的深入研究，发现细胞因子在疾病发生发展的过程中起到非常关键的作用，其中转化生长因子β（transforming growth factor，TGF-β）信号传导通路与肺纤维化关系密切，基于此，为寻求治疗的新途径，国内外学者进行了以其为靶点的实验性肺纤维化治疗研究。该文就肺纤维化中TGF-β信号传导通路及其靶向治疗做一综述。

1 TGF-β家族及影响肺纤维化的信号通路

TGF-β超家族是包含多种多肽类生长因子的家族，主要有TGF-β、骨形成蛋白（bone morphogenic protein，BMP）、激活素、抑制素、穆勒氏管抑制物质（Mullerian inhibitor substance，MIS）、生长分化因子等，参与细胞生长、胚胎发育、组织修复、成骨分化、细胞外基质沉积等。TGF-β超家族成员有以下共同特征：（1）N-末端有1段信号肽序列，可借以跨过内质网；（2）紧靠生物活性区有由4个氨基酸残基（RSRR）组成的蛋白酶加工位点；（3）C-末端包含 9个保守的半胱氨酸的生物活性区，靠分子间的二硫键形成二聚体。

业已证实，纤维增生的病理基础是成纤维细胞活化和广泛的基质重塑。促纤维化因子刺激成纤维细胞过度表达纤维化基质蛋白，促使更多的促纤维化细胞因子表达。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）可以预示成纤维细胞活性，体外实验发现肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cells，肺泡上皮细胞）通过TGF-β介导的间充质转化能通过CTGF的产生激活肺成纤维细胞（lung fibroblast，LF）［5］。在哺乳动物体内 TGF-β 有 3 种亚型，TGF-β1 和 TGF-β2 促进瘢痕组织形成，而TGF-β3有抗瘢痕形成的作用。TGF-β1是一个多功能的细胞因子，参与调控发病机制方面是非常明确的，在肺纤维化发病过程中起着中枢调控的重要作用，是作用最强的致纤维化因子。TGF-β1在组织损伤修复过程主要通过诱导下游经典的Smads（drosophila mothers against decapentaplegic protein）蛋白信号通路和非经典的Smads信号通路，参与肺泡上皮细胞的增殖、凋亡、自噬，诱导成纤维细胞的分化，促进肌成纤维细胞（myofibroblast，MF）的增殖、迁移、侵袭，并维持成纤维细胞持久生存，促进细胞外基质的合成，在IPF发生发展的各个阶段起着主要的促进作用［6］。

2 以 Fstl1-TGF-β1-Smad2/3信号通路为靶位点的抗纤维化治疗

2.1 以Fstl1为靶位点的抗纤维化治疗卵泡抑素样蛋白 1（follistatin-like 1，Fstl1）是一种细胞外的分泌型糖蛋白，富含半胱氨酸，隶属酸性分泌蛋白家族，具有多种生物学功能，参与调控细胞增殖、凋亡、分化、代谢等多种病理生理过程，并通过激活多种信号通路发挥作用。TGF-β1在转录和翻译水平调控Fstl1表达，有研究表明鼠肺成纤维细胞TGF-β1调控 Fstl1表达上调，TGF-β1-Smad3-c-jun通路在这一过程中起到至关重要的作用［7］。Fstl1可以通过促进TGF-β1/Smad2/3信号通路来调控成纤维细胞的活化和细胞外基质的合成，上调细胞外基质表达，具有促纤维化作用［8］。Fstl1的缺失对小鼠的肺脏发育及气管重塑等方面都有不同程度的影响［9，10］。有研究者通过动物体内实验充分证实了使用Fstl1中和抗体能减少小鼠肺纤维化的发展［8］。葛根素提取物能改善百草枯所致的肺纤维化，研究发现葛根素提取物主要是通过抑制微小RNA-21（miR-21）的表达拮抗 Fstl1通路和氧化应激反应，抑制炎症和成纤维细胞增殖，达到减轻肺纤维化的目的［11］。大量研究表明，Fstl1在肺纤维化、炎症、代谢等方面起着重要的作用，随着蛋白组学在临床上的深入研究，Fstl1的功能及其作用机制将会进一步明确，具有潜在的靶向治疗前景。

2.2 以TGF-β1为靶位点的抗纤维化治疗

2.2.1 相关的治疗药物 首先吡非尼酮已被证明是细胞因子和生长因子的调节剂，抑制TGF-β1、血小板衍化生长因子（PDGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达，抑制肿瘤坏死因子 α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-18（IL-18）的产生，减少成纤维细胞增殖分化，减少胶原纤维合成和细胞外基质沉积［12］。吡菲尼酮无论在临床试验还是现实治疗中具有良好的安全性，被FDA认定为是突破性治疗肺纤维化的药物。有学者统计了自1995年以来收录于Pubmed数据库中有关吡菲尼酮治疗IPF的相关文献，IPF中位生存期2.8～4.2年，5年生存率为20%，吡菲尼酮有良好的耐受性，可以延缓用力肺活量 （forced vital capacity，FVC）下降，增加6分钟步行试验距离、延长无进展生存期 （progression-free survial，PFS）、降低死亡率。然而为了达到能够耐受长期用药以从中获益的目标，加强药物不良反应的监管至关重要，主要治疗相关不良事件有胃肠道不适、皮疹和光敏性。为减少药物对胃肠道的刺激，结合药代动力学特点，该药宜在进餐时服用［13，14］。新近有报道采取吡菲尼酮吸入或肺内给药的方式治疗百草枯诱导的肺纤维化模型鼠，通过比较形态学、羟脯氨酸含量、TGF-β1、TNF-α、基质金属蛋白酶组织抑制剂 1（TIMP-1）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）等指标的变化与口服给药对比，发现两者疗效相似但吸入给药用剂量少、不良反应少，认为吸入给药具有很大的潜力［15］。中药川芎嗪不仅可以改善肺脏血液循环，还可以对抗脂质过氧化反应，我国学者对博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型应用丹参联合川芎嗪腹腔注射，发现可下调大鼠血清和支气管肺泡灌洗液中TGF-β1的表达水平，减轻肺泡炎症和肺组织纤维化的进程［16］。再者，如它与血管内皮功能关系密切，促进内皮细胞增殖、迁移、维持血管通透性、促组织纤维化等方面发挥作用，与TGF-β、成纤维细胞生长因子 （fibroblast growth factor，FGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）等共同参与气道重塑。血管改变是气道重塑的特征之一，研究表明，以布地奈德预处理成纤维细胞可抑制磷酸化Smad3水平，降低TGF-β1表达及其诱导的VEGF产生，抑制细胞外基质合成［17］。雾化吸入局部用药作用直接，不良反应小，有望成为临床抗肺纤维化治疗的新选择。维生素D能抑制肺超微结构病变，显著减少肺组织内细胞基底膜的厚度，降低羟脯氨酸水平，下调TGF-β1的表达，从而抑制成纤维细胞增殖活化，有效地减轻肺纤维化的进程［18］。

2.2.2 通过基因技术及细胞分子技术的治疗 该两项技术可干预TGF-β1信号通路的传导，有益于肺纤维化的治疗。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NDAPH氧化酶，NOX）是机体组织氧化应激的酶类，其亚型NOX4在肺泡上皮细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞、气道平滑肌细胞均有表达，产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）参与调控细胞增殖、分化、凋亡，促成肺纤维化的发生。NOX4抑制剂减弱TGF-β1介导的促纤维化基因上调，抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，减少细胞外基质沉积，是抗肺纤维化治疗中很有前景的靶点［19］。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）具有强大的自我复制更新能力，有多向分化潜能，具有免疫调节功能和低免疫原性，加上肺组织高容量低阻力的结构特性，使得MSC易于肺内沉积，在呼吸系统疾病中应用广泛。可下调MMP-9、TIMP-1、INF-γ、TGF-β1，减轻肺泡炎，促进细胞外基质的降解，减轻肺纤维化［20］。 Srour等［21］回顾分析了 17 项有关MSC治疗博来霉素诱导的动物肺纤维化模型的报告，发现MSC主要在初始炎症阶段而非纤维化阶段发挥疗效，能够改善肺纤维化的胶原沉积和Ashcroft病理评分。

2.3 以Smads蛋白为靶分子的抗纤维化治疗Smads蛋白的表达调控在肺纤维化发病机制中起重要作用，Smad3通路抑制剂或提高Smad7的表达以阻断TGF-β1信号转导途径，可能为纤维化疾病的治疗提供一种新手段。

Smad3是主要的TGF-β1/Smads信号通路活化蛋白，Smad3蛋白的正常表达是形成肺纤维化所必需的。成纤维生长因子受体抑制剂ponatinib是一种多靶点激酶抑制剂，主要用于治疗白细胞。但研究表明ponatinib通过抑制TGF-β1/Smad3通路，抑制TGF-β1介导的上皮间充质转化（EMT）和Ⅰ型肺泡上皮（AT1）凋亡，抑制成纤维细胞增殖，延缓肺纤维化进程，拓宽了 ponatinib的治疗领域［22］。 miRNA 的表达与IPF密切相关。博来霉素诱导的上皮间质转化有利于胸膜间皮细胞迁移和胸膜下肺纤维化，而胸膜下肺纤维化是博来霉素肺纤维化模型鼠的病理标志，研究发现纤维化模型鼠肺mir-18a-5p表达减少，而mir-18a-5p已被确定与TGF-β受体Ⅱ的mRNA的3UTR区结合，抑制TGF-β1-Smad2/3通路，因此mir-18a-5p过度表达可抑制TGF-β1介导的胸膜下肺纤维化，为IPF的治疗提供新途径［23］。紫杉醇是临床上应用广泛的抗肿瘤药物，研究发现低剂量紫杉醇通过下调mir-140抑制TGF-β1/Smad3通路，mir-140增加可导致肺泡上皮细胞的上皮间质转化，紫杉醇对此有表型逆转作用，减少胶原沉积，从而发挥抗纤维化的作用［24］。因此Smad3是很有前景的抗纤维化治疗靶点。另一项实验研究表明白介素-27（IL-27）是兼有促炎和抗炎作用的多功能细胞因子，可增加上皮细胞表型标志物表达，抑制TGF-β1诱导的上皮间充质转化，抑制TGF-β1/Smad通路相关蛋白的磷酸化。以Smad3特异性抑制剂SIS3对细胞预处理后，IL-27抑制上皮间充质转化的作用显著增强，从而减轻肺纤维化［25］。传统中药青蒿素除抗疟作用外，还具有抑制生长因子表达、抗炎及免疫调节作用，研究发现双氢青蒿素抑制 TGF-β1、smad2、smad3基因和蛋白表达，通过抑制TGF-β1-Smad2/3通路减轻组织炎症和纤维化程度［26］。

Smad7是TGF-β1/Smads的信号通路最主要的负调蛋白，Smad 7蛋白的上调可以抑制肺纤维化的进程。动物实验发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）通过稳定Smad7水平，防止Smad去乙酰化，降低Smad3活性，抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞分化和胶原表达，抑制TGF-β1诱导的组蛋白去乙酰化酶活性，起到抗肺纤维化作用［27］。另有研究表明甲基转移酶set9可通过上调Smad7蛋白水平抑制TGF-β1介导的细胞外基质沉积和胶原产生，提出蛋白甲基转移酶可作为肺纤维化的治疗靶点的可能性［28］。肺间充质干细胞（lung resident mesenchymal stem cells，LR-MSC）成肌纤维细胞分化在IPF中起重要作用。通过比较miRNAS在LR-MSC成肌纤维细胞分化前后的表达谱，发现mir-877-3p是纤维化相关miRNA，mir-877-3p螯合剂通过smad7通路抑制LR-MSC成肌纤维细胞分化，减轻肺纤维化，提示mir-877-3p具有治疗肺纤维化的潜力，值得深入研究［29］。HasmiR-326调节TGF-β的表达，其水平与人类多种细胞TGF-β蛋白水平呈负相关，人IPF肺标本与非纤维化肺相比，miR-326表达显著减少，在博来霉素诱导的肺纤维化模型鼠TGF-β表达增加与mmu-miR-326相关，miR-326鼻腔给药可以下调转录因子 Ets1、Smad3和 MMP-9，上调Smad7，抑制TGF-β的表达，认为miR-326有助于开发研制肺纤维化的治疗新策略［30］。

综上所述，虽然TGF-β1信号转导通路抑制剂在体内和体外实验中虽然均被证实对抗肺纤维化治疗有效，但用于临床之前，仍需要进行更加深入的研究，以确保治疗的安全有效性。TGF-β1信号的转导与调控是一个涉及多通路多靶点的复杂过程，进一步探明TGF-β1信号传导通路对于发现肺纤维化的有效治疗靶点、开发更有效的治疗药物及治疗技术、控制肺纤维化具有重要意义。