内质网应激干预与神经系统疾病治疗前景

钱琳琳，张萍淑，孟燕，张利平，乔思佳，元小冬

神经退行性疾病的发病机制尚不完全明确，但研究表明氧化应激、内外环境因素、遗传倾向、线粒体功能障碍、内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）等均参与神经退行性疾病的发生发展。较多的文献表明阿尔茨海默病、帕金森病的发病机制与错误、未折叠蛋白的聚集有关[1,2]。同时有相关证据指明ERS在脊髓损伤、缺血性脑损伤、Huntington舞蹈病（Huntington disease，HD）、脊髓小脑共济失调（spinocerebellar ataxias，SCA）等疾病的发生发展中起重要作用。目前，ERS抑制剂苯丁酸甘油酯（Ravicti）已被应用于治疗尿酸循环障碍，并取得较好疗效，但对神经系统疾病的应用尚在动物模型阶段，而4-PBA用于治疗创伤性脑损伤大鼠后其神经系统恢复能力较为显著，认为ERS干预剂在神经系统疾病治疗中的应用前景比较乐观，因此为研究神经系统疾病与ERS的关系奠定基础。

1 ERS

生理状态下，内质网膜中的跨膜蛋白抑制物阻性酯酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、Ⅰ型跨膜蛋白蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）、活 性 转 录 因 子 6（activating transcription factor-6，ATF6）分别与分子伴侣蛋白GRP78/Bip相结合，处于失活状态。当细胞受到氧化应激、Ca2+稳态失衡等刺激后，三种跨膜蛋白与分子伴侣蛋白分离，引发ERS。

内质网途径引发的细胞凋亡主要包括三条通路[3,4]：①CHOP/GADD153基因激活通路：内质网内错误蛋白或未折叠蛋白无法得到纠正时，ATF6持续表达，激活下游细胞凋亡基因CHOP/GADD153表达，CHOP可抑制分子伴侣蛋白GRP78/BIP和抗细胞凋亡基因BCL-2的表达，耗竭谷胱甘肽，增加内质网源性的氧自由基（reactive oxygen species，ROS），使细胞发生凋亡。②JNK通路：长时间激活内质网跨膜蛋白IRE1这一核心感受器通路，会激活TRAF-ASK1-JNK途径，诱发细胞凋亡。③Caspase-12通路：Caspase-12是ERS特有的相关蛋白酶，活化的Caspase-12发生级联反应，最终发生细胞凋亡。

2 体外ERS诱导

2.1 衣霉素与ERS

核糖体合成无活性的蛋白受N端信号肽的控制进入内质网进行修饰，转换具有生物活性的蛋白质，其修饰主要包括二硫键形成、化学修饰（甲基化、乙酰化、糖基化），大多数分泌型蛋白均需要蛋白质糖基化修饰。蛋白质糖基化主要有N-糖苷键、O-糖苷键，N-连接的寡糖都在内质网中进行的。蛋白质的糖基化具有重要的生理作用：①蛋白质的糖基化修饰是其正确折叠、建立稳定空间结构的重要环节。②糖基化修饰后的蛋白具有抵抗蛋白酶消化、持久的生物活性。③参与细胞的信号转导。

衣霉素诱导ERS是通过抑制蛋白质糖基化修饰[5]，在研究中表明1 mg/L的衣霉素可诱导细胞产生自噬作用，但当随着衣霉素浓度的升高及时间的延长，细胞发生凋亡[6]。有明确证据指出在分子水平上，脊髓损伤后ERS相关蛋白CHOP、Caspase-12、elf-2α表达量显著升高，同时与脊髓损伤修复相关69号蛋白（spinal cord injury repair related protein 69，SCIRR69）也可能也与ERS有关，其机制可能是激活bZIP类转录因子后增加SCIRR69的表达[7]，所以认为在脊髓损伤的早期轻度给予衣霉素有助于脊髓损伤修复。

2.2 毒胡萝卜素与ERS

钙离子在内质网通过肌浆/内质网钙离子ATP酶从细胞质内摄入，又通过肌醇-1,4,5-三磷酸受体/钙离子（InaP3）通道释放，内质网膜上的Ⅰ型跨膜蛋白基质相互作用分子1（stromal interaction molecule l，STIM1）是内质网钙库中的Ca2+感受器，内质网中的稳态通过这三个基本结构来实现[8]。钙蛋白酶在内质网中与Caspase-12结合形成钙离子感受器，失衡的Ca2+激活钙蛋白酶，活化的钙蛋白酶进一步激活半胱氨酸家族，剪切相关凋亡蛋白，如BCL-2、P53，并直接剪切活化细胞凋亡执行者Caspase-3、7等，导致其凋亡。

毒胡萝卜素抑制内质网膜中的ATP依赖性钙泵，发生级联反应诱发细胞发生凋亡。使用毒胡萝卜素处理多形性胶质母细胞瘤肿瘤干细胞以激活ERS，观察到肿瘤细胞形态发生皱缩、崩裂，而且其凋亡率增加，凋亡因子CHOP、Caspase-3的表达明显上调[9]。因此，推测毒胡萝卜素可用来治疗相似的肿瘤疾病。

2.3 蛋白酶体抑制剂与ERS

Naidoo[10]报道细胞在进行蛋白翻译修饰过程中大约有1/3的错误折叠蛋白质，而这些蛋白质将通过泛素蛋白酶体（ubiquitin-proteasome system，UPS）途径进行降解。错误、未折叠蛋白由内质网转向高尔基体后被泛素标记，被标记的蛋白质被蛋白酶体识别后降解[11,12]。

因此UPS抑制剂被广泛应用于各种ERS模型的建立。李晓欧等[13]使用不同浓度蛋白酶体抑制剂Eeyarestatin对大鼠肝细胞进行处理，发现随着浓度的递增，大鼠肝细胞ERS标志蛋白CHOP、Caspase-12、Caspase-3、GRP78明显升高并且细胞活性逐渐降低，同时也发现随着浓度的增加自噬标志性蛋白LC3和Beclin 1蛋白表达明显上调，所以蛋白酶体抑制剂能引发蛋白的另一降解途径即自噬，自噬的发生可能与ERS通路中的IRE1、PERK、Ca2+引发的级联反应有关。白东[14]在体外对人星形胶质细胞瘤使用UPS抑制剂（MG-132）后，发现随着MG-132浓度的升高，细胞凋亡率明显升高。当药物浓度大于10 μmol/L时，可显著抑制其增殖分化的能力。

目前蛋白酶体抑制剂多应用于各种肿瘤细胞治疗，细胞凋亡为肿瘤细胞的治疗提供新的思路。Ceruti等[15]对星形胶质细胞瘤细胞株使用蛋白酶抑制剂后可显著增加Caspase-3的表达量，细胞凋亡率明显增加。虽然蛋白酶体抑制为肿瘤细胞治疗方面提供新的视野，但蛋白酶体抑制剂与其他肿瘤治药物缺点相同，缺乏特异性，而且蛋白酶抑制剂在体内对正常细胞、组织的影响也尚未可知，这也是蛋白酶体抑制剂的缺陷。

2.4 棕榈酸与ERS

ERS早期，IRE1通过剪切转录因子X盒结合蛋白1（X box binding protein 1，XBP1）的mRNA中的一个内含子，快速清除在内质网中蓄积的未折叠蛋白，维持细胞内环境的平衡。但ERS持续存在时，活化的IRE1招募肿瘤坏死因子2受体相关因子（TNF-receptor-associated factor2，TRAF2），IRE1与TRAF2一起激活JNK，诱导细胞发生凋亡[16]。XBP1可体内调节脂肪酸合成基因的转录，特异性敲除肝脏细胞中的XBP1基因后，发现小鼠体内的胆固醇及其甘油三酯合成明显下降，小鼠脂肪肝的发生率明显下降[17]。Ozcan等[18]发现肥胖小鼠的肝脏中活化的IRE1 α表达量与正常小鼠相比显著升高，IRE1下游因子磷酸化的JNK也呈现高表达状态。

棕榈酸引发的内质网途径的细胞凋亡机制主要是影响内质网的结构，切断蛋白质从内质网向高尔基体转运通路[19]，而内质网中钙泵被破坏导致Ca2+浓度降低，影响蛋白质的折叠，引发ERS。

3 体外ERS抑制及其机制

3.1 salubrinal及其ERS

内质网发生应激时，PERK与分子伴侣分离，游离的PERK使蛋白翻译起始因子elF-2α磷酸化，阻止蛋白质合成，缓解内质网内的压力。另一方面磷酸化的elF-2α增加下游基因活化转录因子-4（activating transcription factor-4，ATF-4）的表达，ATF-4又活化CHOP（C/EBP homology protein）及 GADD34（growth arrest and DNA damage inducible 34）的表达，同时GADD34可使elF-2α脱磷酸化，合成蛋白质翻译起始复合物，加速处在ERS状态下的细胞凋亡。目前CHOP是如何导致细胞发生凋亡的机制尚不完全清楚，但有资料显示CHOP可增加Bid、Bim等促凋亡蛋白表达，并抑制抗凋亡蛋白的表达[20]。

Salubrinal主要通过抑制elF-2α磷酸化，阻止蛋白质的翻译及抗凋亡蛋白的生成，进而发生ERS[21]。Rubovitch等[22]在对TAC小鼠心肌细胞进行salubrinal处理发现，ERS标志蛋白GRP78、GRP94蛋白表达量下降，有效缓解小鼠的心脏肥大。目前，Salubrinal已被视为神经系统病理学中的神经保护剂，降低ERS并且作为缓解神经损伤的治疗。同时，salubrinal治疗降低脊髓损伤中过强的PERK-eIF2al-pha表达，保护神经细胞。在创伤性脑损伤中，通过salubrinal治疗减轻ERS可防止受损小鼠皮质中的神经元死亡[23]。

3.2 4-苯基丁酸（4-phenyl butyric acid，4-PBA）及其ERS

细胞凋亡过程中PERK、ATF6、IRE1三个ERS途径均可诱导CHOP的表达[24,25]：①PERK通路中，磷酸化的elF-2α可激活ATF4及其下游因子的表达，形成PERK-elF2α-ATF4复合物，促进凋亡因子CHOP的表达。②ATF6属于二型跨膜蛋白，ERS时激活的ATF6进入细胞内并与核转录因子结合形成复合物，复合物进一步激活CHOP。③IRE1属于Ⅰ型跨膜蛋白，IRE1活化后，其细胞内的结构招募TRAF2，形成IRE1-TRAF2-JNK后，激活下游信号分子CHOP。此外，有研究指出，PERK、CHOP、IRE1三个通路既可独立激活CHOP，也可相互影响激活CHOP，诱导细胞凋亡[26]。

4-PBA抑制ERS主要通过以下机制：①抑制CHOP的表达。对小鼠心肌细胞采用10 mmol/L的4-BPA处理后，CHOP、Caspase-3表达量降低，心肌细胞的凋亡率也明显下降[27]，同时其他文献中同时发现低于10 mmol/L 4-PBA不能削弱CHOP的表达，但可通过其他通路，如增加Caspase-3表达量来引发细胞凋亡[28]。②促进泛素蛋白酶途径，缓解内质网中由未折叠蛋白含量增加带来的压力。

4-PBA可作为神经损伤治疗的新型药物，创伤性脑损伤大鼠模型中，Rancan等[29]根据感觉、运动功能的神经行为学评价动物创伤后神经损伤程度，发现使用4-PBA治疗的大鼠与未治疗组相比，其神经功能评分在损伤后72 h内均有所升高，同时处死后大鼠大脑皮质处CHOP在损伤后72 h内4-PBA处理组的表达量显著降低，这表明4-PBA对创伤性脑损伤大鼠具有治疗作用。Yildirim等[30]发现4-PBA可以抑制组蛋白的去乙酰化，增加小鼠脑缺血区部位的组蛋白乙酰化，组蛋白乙酰化可增加保护性蛋白表达如HSP70、Bcl2和下调损伤性蛋白的表达如P53、BAX等而抗神经元缺血性损伤。虽然有较多文献发现4-PBA对动物模型的治疗具有显著意义，但采用的浓度却大相径庭，这可能是由于采用的动物、组织不同造成的。

3.3 硫辛酸与ERS

内质网中大约33%的蛋白质在进行修饰、折叠过程中依赖于氧化还原酶类和细胞内相对较高的氧化应激反应，而细胞内大约25%的ROS参与细胞内蛋白质折叠[31]。ROS通过内质网途径引发细胞凋亡主要包括两个通路：①攻击维持蛋白折叠酶活性所必需的巯基，使内质网中蛋白质被氧化修饰，进而诱导内质网折叠酶或分子伴侣功能异常。②影响内质网Ca2+平衡，氧化应激反应及ROS浓度的改变影响内质网中Ca2+通道，在亚硝酸盐诱导ERS引发的急性早幼粒白血病NB4细胞凋亡的研究中发现，给予ROS抑制剂后可抑制细胞质内Ca2+升高，同时细胞凋亡率也显著下降，说明ROS引发细胞凋亡与Ca2+失衡有关[32]。

4 ERS干预价值及治疗展望

ERS干预应用于神经系统疾病治疗策略：①适量ERS激动剂：适量的ERS可使分子伴侣GRP78/Bid表达量增加，内质网中Ca2+轻度升高，帮助未折叠蛋白增加，提高神经细胞对ERS抵抗力，降低神经细胞凋亡坏死的可能性。如此，ERS预处理法有望应用于脑梗死、帕金森病等神经系统疾病中。②抑制ERS引发的细胞凋亡：CHOP是PERK、ATF6信号通路的下游分子，CHOP的表达增加可抑制抗凋亡蛋白BCl-2的表达，引发内质网途径的细胞凋亡。因此使用CHOP抑制剂可能会减轻由ERS引发的神经退行性病变类疾病。elF-2α是真核细胞蛋白翻译起始因子之一，故抑制其磷酸化可以抑制蛋白质的翻译，缓解内质网压力，这可能为神经系统疾病治疗拓展另一途径。

美国食品药品管理局（FDA）已在2013年2月正式批准将ERS抑制剂Ravicti治疗尿素循环障碍。44例已使用Buphenyl（属于治疗尿素循环障碍的药物）的成年患者被随机分配服用Buphenyl或 Ravicti 2周，然后再转换服用2周Buphenyl或Ravicti中的另一药物，结果显示在控制血液中氨水平方面，Ravicti与Buphenyl一样有效。另外三项在儿童和成年人身上进行的临床研究证实，Ravicti对≥2岁的患者具有长期的安全性和有效性[36]。而虽然ERS干预剂尚未应用于人体，但疗效或许比较客观。

ERS干预剂目前被广泛应用于各种动物模型中，ERS与神经系统疾病的发生、发展有紧密联系，但ERS干预剂治疗人神经系统疾病却存在很多问题需要攻破：①目前很多的ERS阻断剂只是应用于某一条通路，或阻断某一重要因子防止发生级联反应，进而阻止细胞发生凋亡，没有从源头上解决问题，当应激持续存在时，阻断因子的上游将发生大量的蛋白堆积，这对细胞来讲也是一种应激因素。②目前ERS干预剂只应用于各种细胞、动物模型中，体内应用干预剂治疗神经系统疾病目前较少，并且疗效也并不完全明确。③干预剂具有浓度及时间依赖的特点：对于诱导剂及阻断剂需要掌握适量的浓度，对不同类型的干预剂、细胞，不同状态下的细胞所需要的浓度不同，高浓度或低浓度将导致细胞发生相反的作用。如达到相同效果的ERS下衣霉素对肝细胞的与心肌细胞所需的浓度也不尽相同。笔者也认为同一干预剂对不同年龄段的细胞处理浓度也不相同，因此需要进行大量的基础研究及动物模型对ERS干预剂的浓度进行调试，希望为今后的临床工作开展提供基石。

尽管大量研究已证明某些特殊蛋白和错误折叠蛋白通过ERS与某些神经疾病有相关性，但ERS与神经疾病之间相互作用迄今仍没有明确的答案。因此，研究ERS机制与神经疾病之间的关系，对ERS进行干预可为神经系统病变提供新的治疗思路。