氧化剂体外诱导对阿萨希毛孢子菌致病性影响的实验研究

李海涛，区敏仪，敖俊红，祝 贺，杨蓉娅

近30 多年以来，随着糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛应用，以及恶性肿瘤、大面积烧伤、器官移植、血液病、艾滋病患者的日益增多，机会性真菌感染，特别是深部真菌感染的发病率呈显著上升趋势，已成为这些患者死亡的主要原因之一。除念珠菌病、曲霉病、隐球菌病等常见的真菌感染性疾病外，由非念珠菌属酵母菌所致的真菌感染在免疫受损人群中日渐增多[1-4]，特别是深部播散性感染者病情严重，病死率高。阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T.asahii）作为毛孢子菌属中最重要的临床致病菌，可引起浅表皮肤感染、播散性系统性内脏器官的感染以及夏季超敏性肺炎[5]，其引起的深部侵袭性感染病死率达70%以上，近年来该病发病率呈显著上升趋势[2,3]。

既往研究表明，病原微生物的抗宿主氧化杀伤与其致病性密切相关，这一点在酿酒酵母、念珠菌、烟曲霉、隐球菌等常见致病真菌的研究中已经得到证实[6-8]。但是，关于T.asahii抗氧化杀伤方面的研究还非常少。本研究拟通过体外诱导的方式，将2 种氧化剂与T.asahii作菌株体外共培养进行体外诱导，将诱导前后的T.asahii菌株注入到有联合免疫缺陷的裸鼠体内，观察T.asahii被氧化剂诱导前后对动物致病性的变化，为T.asahii感染与致病机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1 实验菌株 阿萨希毛孢子菌共2 株，T.asahii标准株CBS2479、环境株CBS8904 均购自荷兰皇家艺术与科学学院真菌多样性研究中心（CBS-KNAW）。

1.1.2 实验动物及分组 Balb/c 裸鼠（联合免疫缺陷鼠）168 只，雌性，6 周龄，平均质量30 g，购自北京大学医学部实验动物部，饲养于北京大学医学部实验动物部SPF 级动物室中。将小鼠分为7 组，CBS2479 组（菌株1）、CBS2479 H2O2诱导组（菌株2）、CBS2479 甲萘醌诱导组（菌株3），CBS8904 组（菌株4）、CBS8904 H2O2诱导组（菌株5）、CBS8904甲萘醌诱导组（菌株6），以及空白对照组（定为菌株7），每组24 只小鼠。再将每组分为4 个小组，每组6 只。

1.1.3 主要试剂与仪器 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）干粉（德国默克公司），蛋白胨干粉和葡萄糖干粉（北京化学试剂有限公司），酵母粉（英国OXOID 公司），30%过氧化氢（美国Sigma 公司），亚硫酸氢钠甲萘醌（美国Sigma 公司），二酰胺（美国Sigma 公司），YPD 液体培养基（美国Gibco 公司）

1.2 实验方法

1.2.1T.asahii菌株氧化剂体外诱导 制备经传代纯化的单克隆T.asahiiCBS2479、CBS8904 的菌悬液，调整浓度为1～5×106CFU/ml，取100 µl 菌悬液加入10 ml 不含H2O2的YPD 培养液中，37℃振荡培养10 h 后加入H2O2，使其浓度达8 µg/ml（CBS2479、CBS8904 菌株的1/2MIC H2O2）后继续培养，当培养菌液达到约0.5 麦氏单位时转至同一H2O2浓度的培养液中培养，每个浓度梯度转种2～3 次。以同样方法进行下一浓度的培养，直至H2O2或甲萘醌的诱导浓度达到64 µg/ml 或者菌株被杀死不再生长，即终止诱导。将所得菌株以40%甘油保存于-80℃中。

1.2.2 各组T.asahii菌株菌悬液配制 将各组菌株传代纯化后的新鲜菌落接种于YPD 液体培养基中37℃生长48 h，取适量菌悬液，将YPD 培养基成分清洗干净后，用生理盐水分别配成浓度为1×105、1×106、1×107及1×108的菌悬液，分装于2 ml 离心管中备用，空白对照组用生理盐水替代菌悬液。

1.2.3 各组菌株致病性测定 取各组小鼠尾静脉，常规消毒后，向其尾静脉注入上述4 个梯度浓度的菌悬液500 µl，观察并记录30 d 内各组小鼠的死亡时间、死亡只数，绘制生存曲线图，并用SPSS20.0 按Bliss法计算出半数致死量（median lethal dose，LD50）[9,10]。（LD50=lg-1[Xn-i(2∑m+h/2n-0.75)]，其中Xn 为最高反应组的对数剂量，i 为组距，即等差数列的对数剂量的公差，m 为各组动物反应数，∑m 各组动物反应数的总和，n 为每组动物数，h 为首末两组动物数的平均数）比较它们的致病性差异。

1.3 统计学方法

应用SPSS20.0 软件分析，两组间比较采用配对样本t检验和独立样本t检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组T.asahii 菌株半数致死量测定结果

菌株1（CBS2479 组），即CBS2479 未诱导组的LD50为7.2361×105，而H2O2诱导后的菌株2（CBS 2479-H2O2诱导组）的LD50为6.0139×105，甲萘醌诱导后的菌株3（CBS2479-甲萘醌诱导组）的LD50为 8.1802×104，诱导后菌株的LD50浓度明显低于诱导前，其中甲萘醌诱导组，即菌株3 的LD50浓度低于未诱导组——菌株1（CBS2479 组）1 个数量级（约10 倍），H2O2诱导组的LD50浓度则比未诱导组——菌株1 低了1.2 倍。菌株4（CBS8904 组），即CBS8904 未诱导组的LD50为8.9643×107，而H2O2诱导后的菌株5（CBS8904-H2O2诱导组）的LD50为4.0437×107，甲萘醌诱导后的菌株6（CBS8904-甲萘醌诱导组）的LD50为1.8971×106，诱导后菌株的LD50浓度也明显低于诱导前。其中菌株6 的LD50浓度低于未诱导组——菌株4（CBS8904 组）1.5 个数量级（约47 倍），菌株5 的LD50浓度则比未诱导组——菌株4 低了2 倍（表1）。

2.2 各组小鼠生存率比较

氧化剂诱导后的临床株菌株3（CBS2479-甲萘醌诱导组）和菌株2（CBS2479-H2O2诱导组）接种的小鼠分别在第9 天、第11 天全部死亡，生存率为0；而未诱导的菌株1（CBS2479 组）接种的小鼠在第9 天时有50%存活，生存率为50%，第11 天时生存率降低为10%，但是之后再没有小鼠死亡。氧化剂诱导后的环境株菌株6（CBS8904-甲萘醌诱导组）和菌株5（CBS8904 -H2O2诱导组），接种的小鼠在第11 天的生存率分别20%和60%，而未诱导的菌株4（CBS8904组）接种的小鼠，在第6 天时生存率是70%，第6 天之后，一直到观察终点（第30 天）所有小鼠均存活，没有死亡。空白对照组所有小鼠在观察期内全部存活，生存率为100%（图1）。

3 讨论

随着广谱抗生素、糖皮质激素的普遍使用，以及器官移植术、侵入性介入技术的普及，条件致病真菌感染的发生率呈逐年上升趋势。病原体微生物（包括细菌、真菌和病毒等）侵入人体后，诱导人体进入氧化应激状态。吞噬细胞是人体抵抗其感染的第一道防线，释放大量活性氧递质（reactive oxygen species，ROS）来杀灭病原体[11,12]。病原微生物为了生存，会启动自身的一系列抗氧化机制，来对抗机体的氧化杀伤，为它们的侵袭感染和致病创造条件，因此，病原微生物的抗氧化机制与其致病性密切相关，这一点在酿酒酵母、念珠菌、烟曲霉、隐球菌等常见致病真菌的研究中已经得到证实[6-8]，但T.asahii在这一领域的研究还比较少。

Zong 等[13]研究发现，H2O2、甲萘醌、二酰胺可对T.asahii产生不同程度的氧化杀伤作用。Zhang等[14]也发现不同来源T.asahii的抗氧化酶过氧化氢酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性不同，提示T.asahii也具有抗氧化防御机制。区敏仪等[15]通过2 种氧化剂体外诱导的方式成功获得了T.asahii体外抗氧化菌株，并对诱导前后菌株的药物敏感性和生物学进行了研究，发现诱导后T.asahii的药物敏感性明显降低，MIC值显著上升，菌株的肉眼形态和光镜下形态均有明显变化。

本研究主要通过体外诱导的方式获得诱导前后T.asahii菌株，再将诱导前后的T.asahii菌株注射到联合免疫缺陷鼠体内，观察小鼠的死亡情况，对诱导前后T.asahii菌株的致病性进行评价。结果发现菌株1（CBS2479 组），即CBS2479 未诱导组的LD50为7.2361×105，而H2O2诱导后的菌株2（CBS2479-H2O2诱导组）的LD50为6.0139×105，甲萘醌诱导后的菌株3（CBS2479-甲萘醌诱导组）的LD50为 8.1802×104，诱导后菌株的LD50浓度明显低于诱导前，其中甲萘醌诱导组，即菌株3 的LD50浓度低于未诱导组——菌株1（CBS2479 组）1 个数量级（约10 倍），H2O2诱导组的LD50浓度则比未诱导组——菌株1 低了1.2 倍。菌株4（CBS8904 组），即CBS8904 未诱导组的LD50为8.9643×107，而H2O2诱导后的菌株5（CBS8904 H2O2-诱导后组）的LD50 为 4.0437×107，甲萘醌诱导后的菌株6（CBS8904——甲萘醌诱导后组）的LD50为1.8971×106，诱导后菌株的LD50浓度也明显低于诱导前。其中菌株6 的LD50浓度低于未诱导组——菌株4（CBS8904 组）1.5 个数量级（约47 倍），菌株5 的LD50浓度则比未诱导组——菌株4低了2 倍。研究结果提示，2 种氧化剂诱导后，无论是临床株CBS2479，还是环境株CBS8904，其致病性均显著上升，其中环境株CBS8904 受氧化剂诱导后，其致病性比临床株CBS2479 升高的更明显，但是环境株CBS8904 三组的整体LD50的浓度高于临床株CBS2479 一个数量级，提示环境株CBS8904 经氧化剂诱导后，其致病性虽显著升高，但是其致病能力仍低于临床株CBS2479。分析原因可能为，CBS 8904 三组是体外氧化剂诱导组，只有氧化剂一个单一因素，氧化剂体外诱导，虽能模仿体内环境，但和机体内环境仍然有较大差异。而临床株CBS2479 是从人体分离出来的致病菌，其与人体相互作用机制复杂，除了抗氧化机制之外，还有其他机制参与其中，不是单纯的体外诱导能完全模拟的。

表1 各组T.asahii的半数致死量（LD50）比较

图1 各组菌株动物致病性比较

本研究对接种至裸鼠的7 株菌致病性进行了观察，结果发现，氧化剂诱导后的临床株菌株3（CBS2479-甲萘醌诱导组）和菌株2（CBS2479-H2O2诱导组）的致病性显著升高，两组菌株接种后的小鼠分别在第9 天、第11 天全部死亡，生存率是0；而未诱导的菌株1（CBS2479 组）接种后的小鼠在第9天时有50%存活，生存率是50%，第11 天时生存率降低为10%，但是之后再无小鼠死亡。

氧化剂诱导后的环境株菌株6（CBS8904-甲萘醌诱导组）和菌株5（CBS8904 H2O2-诱导组）接种的小鼠在第11 天的生存率分别为20%和60%，而未诱导的菌株4（CBS8904 组）接种的小鼠在第6 天时生存率是70%，第6 天之后，一直到观察终点（第30 天）所有小鼠均存活，没有死亡。空白对照组所有小鼠在观察期内全部存活，生存率为100%。从生存曲线图可以看到，经氧化剂诱导后的菌株致病性明显增强，小鼠生存率显著降低。对2 种氧化剂诱导后的菌株致病性比较发现，甲萘醌诱导后T.asahii菌株，无论是临床株，还是环境株，其致病性均高于相应H2O2诱导的菌株，而且氧化剂诱导后的T.asahii菌株，无论是甲萘醌诱导的，还是H2O2诱导的，临床株（CBS2479）的致病性也高于环境株（CBS8904）。本课题组Zong 等[13]前期的研究也发现，H2O2、甲萘醌、二酰胺均可对T.asahii产生不同程度的氧化杀伤作用，但甲萘醌杀伤作用最强，二酰胺次之，H2O2最弱，说明甲萘醌的氧化杀伤作用要远远比H2O2强。因此，笔者分析，由甲萘醌体外诱导的T.asahii菌株的致病性要高于由H2O2体外诱导的T.asahii菌株，可能由于甲萘醌的氧化杀伤作用比H2O2更强，因而由它诱导出来的T.asahii菌株抗氧化能力则更强，但具体机制尚不清楚，需要进一步研究来阐明。

总之，本研究通过应用2 种氧化剂H2O2和甲萘醌在体外分别对T.asahii临床株和环境株进行诱导，观察诱导前后菌株的致病性，结果发现诱导后菌株致病性显著高于诱导前，而甲萘醌诱导的菌株致病性高于H2O2诱导菌株，本研究从一个角度证明了T.asahii菌株对机体的感染或致病机制有抗氧化机制的参与，下一步将从组学的角度对T.asahii感染人体的抗氧剂机制进行深入研究。