miR-130b在人视网膜母细胞瘤中的表达及促癌机制研究

杨 夏，吴 涛

0引言

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)是一种起源于视网膜胚胎性核层细胞的恶性肿瘤，其患病群体主要为5岁以下的婴幼儿。相关流行病学研究显示，RB在5岁以下儿童中的发病率为11.8/100万，占同龄儿童恶性肿瘤的6.1%[1]。RB的死亡率在欧美发达国家为3%～5%，而在亚洲与非洲则高达40%～70%[2]。RB严重危害患儿的视力、生活质量乃至生命。近年来，随着肿瘤综合治疗相关技术的革新与进步，趋于更微观层次的分子靶向治疗显示出了愈发理想的治疗前景，其中小分子核糖核酸(microRNA，miRNA)对其靶基因表达的调控对肿瘤发生及病情进展的影响逐渐成为该领域的研究热点之一。新近研究表明，miR-130b在不同肿瘤组织中均存在表达异常的情况，且与肿瘤细胞增殖、浸润、转移、化疗抵抗以及多项不良预后具有密切关联[3-6]。但miR-130b是否对RB也同样存在某种影响，目前国内外就此方面研究相对较少。本研究通过检测miR-130b在RB组织中的表达水平并初步探讨其可能性促癌机制，以期为RB的发生机制提供新的理论基础，继而为临床治疗开辟新思路。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1标本采集选取2013-07/2017-08期间在我院眼科中心接受眼球摘除术治疗的RB患儿29例29眼，其中男16例16眼，女13例13眼；年龄3mo～6岁，平均2.5±0.8岁。所有患儿在入选本研究前均未接受过化疗与局部放疗。取每例患儿RB癌组织及相应癌旁组织(距肿瘤边缘1～2cm范围内组织)标本，每份标本均经我院病理科进行病理检查确诊。将收集到的标本放至液氮中保存待用。相关标本的收集程序、方法及后续各项实验方案均已通过我院医学伦理委员会审查，入选患儿家属均签署知情同意书。

1.1.2主要试剂和仪器主要试剂：人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologuedeleted on chromosome 10，PTEN)过表达及对照、PTEN干扰及对照购自RiboBio公司；RNeasy Mini Kit(50)试剂盒购自MULTI SCIENCES公司、mRNA反转录试剂盒、miRNA反转录试剂盒购自美国Ferments公司；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒购自德国Qiagen公司；BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司；Akt、p-Akt 308、p-Akt 473兔抗人多克隆抗体购自Bio-Rad公司；Triton X-100购自美国Dow Chemical公司；PTEN抗体购自英国Abcam公司；LipofectamineTM2000 Reagent购自美国Invitrogen公司。主要仪器：5% CO2培养箱371型购自Thermo Fisher公司；低温超速离心机ALLEGRA X-15R型购自Beckman Coulter公司；倒置荧光显微镜Axio Observer A1/D1/Z1型购自德国Carl Zeiss公司；电泳仪、湿转仪、摇床购自美国Bio-Rad公司；荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司。

1.2方法

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1.2.1细胞培养和转染采用含10%胎牛血清的RMPI-1640与MCDB-131培养基分别于37℃、5% CO2恒温培养箱内培养人RB细胞系HXO-Rb44与Y79(上海子实生物)及人正常视网膜血管内皮细胞系ACBRI-181(ATCC)。采用miR-130b mimics对HXO-Rb44细胞中的miR-130b进行过表达，对照物为miR-NC。采用anti-miR-130b对Y79细胞中的miR-130b进行下调处理，对照物为anti-miR-NC。分别采用miR-NC+PTEN-NC、miR-130b mimics+PTEN-NC、miR-NC+PTEN、miR-130b mimics+PTEN对HXO-Rb44细胞进行共转染。分别采用anti-miR-NC+siSCR、miR-130b inhibitor+siSCR、anti-miR-NC+siPTEN、miR-130b inhibitor+siPTEN对Y79细胞进行共转染。转染后的细胞培养条件同前。

1.2.2qRT-PCR检测参照试剂盒说明书提取总RNA(包括miRNA)，根据试剂盒操作说明检测组织样本及相关细胞系miR-130b表达水平，以U6小RNA为内参对照，采用2-△△Ct相对定量法处理数据。采用SYBR Green荧光定量PCR混合液与GAPDH为内参检测PTEN基因的相对表达量，同时采用2-(Ct目的基因-Ct内参)计算PTEN靶基因的相对表达量。相关引物序列分别为：miR-130b(5’- CAGGCAAGAGAAAGGGCA -3’)；PTEN(5’-TGCAGATAATGACAAG-3’)；GAPDH(5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’)；U6(5’-CTCGCTTCGGCAGCAC-3’)。

1.2.3WesternBlot检测采用RIPA裂解缓冲液(含1% PMSF)裂解总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白煮沸变性，上样40μg/孔。12% SDS-PAGE电泳分离，恒流条件下PVDF转膜。采用含5%脱脂牛奶的TBST缓冲液在37℃条件下封闭2h。一抗(1∶1000)孵育，4℃过夜。TBST洗膜3次。二抗(1∶5000)孵育，37℃ 2h。TBST洗膜3次。最后采用ECL免疫印迹发光试剂盒进行检测。

1.2.4免疫荧光染色分析重悬对数生长期细胞，调整密度约为1×105/mL，平皿(d=3.5cm)接种后于37℃、5% CO2恒温培养箱内培养。细胞贴壁后去培养基，预温PBS(37℃)清洗3次。采用10%甲醛固定40min，PBS清洗3次，每次10min。采用浓度为0.2% Triton X-100透化处理5min，清洗。采用5% BSA(500μL/孔)室温封闭1h。加一抗(1∶100)，放置到湿盒内4℃过夜，复温45min后采用PBS摇洗3次；加二抗(1∶400)，37℃避光放置30min，PBS摇洗3次。室温条件下DAPI染色5～10min，去DAPI后采用PBS避光摇洗3次。最后进行荧光显微镜镜检。

1.2.5双荧光素酶报告基因试验合成序列miR-130b：3’-GGAAAGUAGUAACGUGA-5’，携带PTEN-3’非翻译区(3’UTR)目的片段的质粒：野生型PTEN 3’UTR(PTEN 3’UTR WT)：5’-UCCUACCCCUUUGCACU-3’、突变型PTEN3’UTR(PTEN 3’UTR MUT)：5’-UCCUACCCCUUAGGAGU-3’。将后两种序列分别构建到pmirGLO双萤光素酶报告基因载体质粒上。取对数生长期HEK293T细胞，以每孔7.5×104个细胞接种于24孔板中，细胞培养箱培养1d。更换为无血清培养基。将miR-130b mimics及miR-130b control分别与PTEN的空质粒(PTEN-NC)、野生质粒(wt-PTEN)以及突变质粒(mut-PTEN)进行组合，共计6组，每组包括4个副孔。将100μL无血清培养基、2μL LipofectamineTM2000、20pmol RNA(1μL)、0.4μg质粒(4μL)等物质加至EP管内并配匀，室温静置20min再分别加至相应孔板。根据双荧光素酶检测试剂盒说明书，48h后加20μL PLB裂解液，裂解后加到96孔板，加100μL荧光素酶检测试剂Ⅱ(luciferase assay reagentⅡ，LARⅡ)后进行萤火虫荧光酶活性检测。最后加100μL Stop & Glo©试剂湮灭萤火虫荧光素酶活性并激活海肾荧光素酶活性，检测miR-130b mimics+wt-PTEN与miR-130b mimics+mut-PTEN组的萤火虫荧光素酶活性改变情况。

图1qRT-PCR检测miR-130b在人RB癌组织和癌旁组织及人RB细胞系中的表达A：miR-130b在人RB癌组织与癌旁组织中的表达(aP<0.05vs癌旁组织)；B：miR-130b在ACBRI-181、HXO-Rb44、Y79三种细胞系中的表达(aP<0.05vsACBRI-181)；C：miR-130b在经miR-130b mimics转染后的HXO-Rb44细胞中的表达(aP<0.05vsHXO-Rb44)；D：miR-130b在经miR-130b inhibitor转染后的Y79细胞中的表达(aP<0.05vsY79)。

图2PTEN在人RB癌组织和癌旁组织中的表达及其与miR-130b的相关性A：qRT-PCR检测PTEN在人RB癌组织与癌旁组织中的表达(aP<0.05vsRB癌组织)；B：miR-130b表达与PTEN表达的相关性。

2结果

2.1miR-130b在人RB癌组织和癌旁组织及人RB细胞系中的表达miR-130b在人RB癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(t=3.273，P=0.002，图1A)。与ACBRI-181细胞比较，miR-130b在HXO-Rb44与Y79细胞中的表达水平显著增高，其中miR-130b在Y79细胞中的表达水平最高(3组比较：F=549.619，P<0.001；ACBRI-181vsHXO-Rb44：t=-23.208，P<0.001；ACBRI-181vsY79：t=-32.109，P<0.001；HXO-Rb44vsY79：t=-8.901，P<0.001，图1B)。HXO-Rb44细胞转染miR-130b mimics后，miR-130b表达水平显著增高(3组比较：F=1725.913，P<0.001；miR-NCvsHXO-Rb44：t=-0.489，P=0.626；HXO-Rb44vsmiHXO-Rb44：t=-51.124，P<0.001；miR-NCvsmiHXO-Rb44：t=-50.635，P<0.001，图1C)。Y79细胞转染miR-130b inhibitor后，miR-130b表达水平显著降低(3组比较：F=1427.198，P<0.001；Y79vsanti-miR-NC：t=2.159，P=0.034；Y79vsinY79：t=47.307，P<0.001；anti-miR-NCvsinY79：t=45.148，P<0.001，图1D)。

2.2PTEN为miR-130b的靶基因

2.2.1PTEN在人RB癌组织和癌旁组织中的表达及其与miR-130b的相关性与人RB癌组织比较，PTEN在其癌旁组织中的表达水平显著增高(t=-4.329，P<0.001，图2A)。相关性分析显示，miR-130b表达水平与PTEN表达水平呈负相关性(r=-0.5608，P<0.001，图2B)。

2.2.2PTEN在人RB细胞系中的表达Y79细胞中PTEN mRNA与蛋白的表达水平均显著低于HXO-Rb44细胞(qRT-PCR检测结果：t=-12.071，P<0.001，图3A)。过表达miR-130b后的HXO-Rb44细胞中PTEN mRNA与蛋白表达水平均显著降低，而干扰miR-130b后的Y79细胞PTEN mRNA与蛋白表达水平均显著升高(qRT-PCR检测结果：miR-NCvsmiHXO-Rb44：t=7.951，P<0.001；anti-miR-NCvsinY79：t=9.588，P<0.001，图3B、C)。

图3PTEN在人RB细胞系中的表达A：qRT-PCR和Western Blot法检测HXO-Rb44与Y79细胞中的PTEN表达(aP<0.05vsHXO-Rb44)；B：qRT-PCR和Western Blot法检测转染后HXO-Rb44与Y79细胞中的PTEN表达(aP<0.05vsmiR-NC;cP<0.05vsanti-miR-NC)；C：免疫荧光法检测HXO-Rb44和Y79细胞中PTEN表达(×400)。

图4双荧光素酶报告基因试验结果aP<0.05vsmiR-130b mimics+PTEN-NC。

图5WesternBlot法检测miR-130b对RB细胞系PI3K/Akt信号通路表达的影响A：过表达miR-130b对HXO-Rb44细胞PI3K/Akt信号通路表达的影响(aP<0.05vsmiR-NC)；B：下调miR-130b对Y79细胞PI3K/Akt信号通路表达的影响(aP<0.05vsanti-miR-NC)。

2.2.3双荧光素酶报告基因试验结果与miR-130b mimics+PTEN-NC组比较，miR-130b mimics+wt-PTEN的萤火虫荧光素酶活性大幅度降低(t=7.298，P<0.001)，但miR-130b mimics+mut-PTEN组未发生明显改变(t=0.228，P=0.820，图4)。

2.3miR-130b对RB细胞系PI3K/Akt信号通路表达的影响过表达miR-130b后的HXO-Rb44细胞p-Akt 308、p-Akt 473蛋白的表达水平相较miR-NC组均显著升高(t=-11.724、-9.225，均P<0.001)，总Akt蛋白表达水平无显著差异(t=-0.773，P=0.443)，见图5A。下调miR-130b后的Y79细胞p-Akt 308、p-Akt 473蛋白的表达水平相较anti-miR-NC组均显著降低(t=14.260、10.821，均P<0.001)，总Akt蛋白表达水平无显著差异(t=-1.317，P=0.193)，见图5B。

2.4PTEN与miR-130b对RB细胞系PI3K/Akt信号通路表达的影响四种共转染的HXO-Rb44细胞p-Akt 308、p-Akt 473、PTEN蛋白表达水平有明显差异(F=83.043、62.943、111.091，均P<0.001)，总Akt蛋白表达水平无明显差异(F=0.978，P=0.406)；共转染miR-130b mimics+PTEN-NC HXO-Rb44细胞p-Akt 308与p-Akt 473蛋白表达水平显著增高(均P<0.05)，PTEN蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；共转染miR-130b mimics+PTEN HXO-Rb44细胞中，以上三种蛋白表达水平均未发生明显改变(均P>0.05)，见图6A。四种共转染的Y79细胞p-Akt 308、p-Akt 473、PTEN蛋白表达水平有明显差异(F=193.123、369.911、274.311，均P<0.001)，总Akt蛋白表达水平无明显差异(F=0.568，P=0.637)；共转染miR-130b inhibitor+siPTEN Y79细胞p-Akt 308与p-Akt 473蛋白的表达水平无明显差异(308：t=0.244，P=0.808；473：t=-0.271，P=0.808)，图6B。

3讨论

RB是当前最为常见且危害程度最高的儿童眼内恶性肿瘤。随着RB治疗理念的进步，其国内治疗发展趋势正逐步朝发达国家靠拢，尽量避免行患眼眼球摘除术或眼眶内容物剜出术。常用的保守治疗方法则主要包括放疗、经瞳孔温热疗法、化学减容疗法以及激光光凝等，但各种保守疗法均存在不足[7-8]。随着分子生物学研究的深入，针对已明确的由肿瘤细胞内部某一个蛋白分子或基因片断所形成的致癌位点开展分子靶向治疗，为改善RB的整体临床治疗效果增加了可能性。

图6WesternBlot法检测PTEN与miR-130b对RB细胞系PI3K/Akt信号通路表达的影响A：PI3K/Akt信号通路相关蛋白在HXO-Rb44细胞中的表达；B：PI3K/Akt信号通路相关蛋白在Y79细胞中的表达。

miRNA是一类具有进化高度保守特征的小分子非编码RNA，约含22个核苷酸，广泛存在于动植物及某些病毒体内。成熟miRNA分子能与靶基因mRNA的3’UTR区域进行完全或不完全互补配对，继而促使靶基因mRNA降解或阻滞蛋白表达[9]。miR-130b家族因被发现在某些癌症中发挥重要作用而受到广泛关注，该家族成员包括分别位于人染色体11q12.1与22q11.21上的miR-130a和miR-130b。其中miR-130b在不同类型肿瘤中的作用具有差异性，表现出类似原癌基因或抑癌基因的生物学功能[10]。研究发现，miR-130b在食道癌组织与胃癌组织中呈高表达，能促进肿瘤细胞的增殖与转移或降低凋亡，可视为致癌基因[11-12]；在胰腺癌组织和细胞中呈异常低表达，能减少肿瘤细胞的增殖与转移，可视为抑癌基因[3]。本研究经qRT-PCR检测发现，miR-130b在RB癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)，且其在RB细胞系中的表达水平较正常视网膜血管内皮细胞也显著增高(P<0.05)。提示miR-130b在RB中可能发挥促癌作用，故研究miR-130b的靶基因有利于更加明确其在RB中的作用机制。

PTEN为一种位于染色体10q23区域的具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，研究发现多种恶性肿瘤的发生发展均与PTEN结构与功能异常具有密切关联[13-14]。Meng等[15]在肝癌中首次证实了PTEN mRNA 3’UTR可直接与miR-21结合，继而使PTEN的抑癌功能被抑制。之后陆续有研究发现在多种肿瘤组织中均有不同miRNA与PTEN靶向结合的情况[16-17]。可以认为在这些特定的肿瘤中，表达异常的miRNA参与了PTEN的表达调控。故本实验选择PTEN作为miR-130b在RB作用机制研究的准靶基因。基于靶基因预测的假阳性率普遍较高，本研究不仅考察了PTEN在HXO-Rb44细胞与Y79细胞中的表达水平以及与miR-130b表达的相关性，同时也采用了双荧光素酶报告基因试验进行证实，结果表明miR-130b表达水平与PTEN表达水平呈负相关性，miR-130b在基因水平与蛋白水平均可对PTEN的表达产生影响，且miR-130b可直接靶向结合PTEN mRNA 3’UTR。进一步机制则可能与Akt信号通路的激活有关。已有研究发现，miR-221/222与miR-22等miRNA分子均在靶向作用PTEN后继而激活Akt信号通路产生促癌作用[16-17]。另一项关于膀胱癌的报道指出，PTEN为PI3K/Akt信号通路的负调节剂，可将PI3K/Akt通路的调节元件作为其潜在的治疗靶点[18]。本研究结果显示，在共转染miR-130b mimics+PTEN-NC的HXO-Rb44细胞中，p-Akt 308与p-Akt 473蛋白表达水平显著增高(P<0.05)，PTEN蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，而在共转染miR-130b mimics+PTEN的HXO-Rb44细胞中，以上三种蛋白表达水平均未发生明显改变。提示在RB中，miR-130b也可能是通过负向调控PTEN对PI3K/Akt信号通路的表达产生影响。

综上所述，本研究发现miR-130b在RB组织及细胞系中呈高水平表达，miR-130b可能是经负向调控PTEN对PI3K/Akt信号通路的表达产生影响，最终发挥促癌作用。miR-130b有望成为RB基因治疗的有效分子靶点。