CRISPR/Cas系统在人眼相关疾病中的应用

姜梦圆，刘红玲

0引言

目前的DNA编辑方法可以根据其靶向机制大致分为两组：蛋白质定向和核苷酸定向的编辑技术。锌指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFNs)和转录激活物样效应核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)是研究最多的蛋白质定向DNA编辑技术，而CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated gene)技术是一种核苷酸定向的DNA编辑技术。CRISPR/Cas技术在诱导遗传修饰方面显示了更高的效率，并且它不涉及靶特异性蛋白质，只需要调整单个sgRNA的短区域便可以实现靶向特异性，故较ZFNs和TALENs表现出明显的优势。此外，基于CRISPR的方法可以规避病毒载体能力的局限性，因此CRISPR/Cas系统可以广泛应用于研究及治疗各种疾病[1-2]。研究报道1/4～1/3的人类疾病与遗传密切相关。现已发现的遗传性疾病约有4000种，其中遗传性眼病和有眼部表现的全身遗传性疾病约有600种[3]。由于这些疾病的病因尚未完全阐明且无有效的治疗方法，因此严重影响患者的视力和生活质量。近几年随着CRISPR/Cas系统的研究和发展，遗传性眼病的致病机制在基因水平上得到进一步诠释，从而为今后应用CRISPR/Cas系统治疗此类疾病带来了新的希望。

1 CRISPR/Cas系统概述

成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)是由一系列短的高度保守的正向重复序列(repeats)与长度相似的间隔序列(spacers)间隔排列组成。CRISPR位点附近存在着一系列保守的CRISPR相关基因(CRISPR-associated gene，Cas)，Cas基因编码的蛋白具有核酸相关的功能域。CRISPR位点的第一个重复序列上游有CRISPR前导序列，即启动子，启动CRISPR序列的转录，转录产生的非编码RNA被命名为CRISPR RNAs(crRNA)。这些crRNA和Cas蛋白共同参与CRISPR免疫防御过程[4]。

1987年，CRISPR序列在大肠杆菌的基因组中被首次发现，随后，在其他细菌和古菌中也发现了这一特殊序列。2005年，发现这些CRISPR序列和噬菌体的基因序列匹配度很高，说明CRISPR 可能参与了微生物的免疫防御。2011年，CRISPR/Cas系统的分子机制被揭示：当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR 转录生成前体crRNA (pre-crRNA)，pre-crRNA 经过加工形成含有与外源基因匹配序列的crRNA，该crRNA与病毒基因组的同源序列识别后，介导 Cas 蛋白结合并切割，保护自身免受入侵。直到2012年，Jinek等[5]发现了链霉菌属中的Type II型CRISPR-Cas系统，至此实现了基因编辑的重大突破。在医学领域，CRISPR/Cas9基因编辑技术也在构建疾病模型及修复疾病模型方面显现出独特的优势。

II型CRISPR-Cas9系统由Case9核酸酶和单一的向导RNA(single guide RNA)组成。在sgRNA的指引下，Case9核酸酶对靶标DNA的特异性剪切主要通过识别保守的原间隔序列临近序列(protospacer adjacent motif，PAM)来进行[6]。靶标DNA断裂后，可以通过两种机制进行修复。如果没有同源模板则直接修复，发生非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)。如果存在同源模板，则发生同源性定向修复(homology directed repair，HDR)[2]。

2 CRISPR/Cas系统在眼科学中的应用

2.1CRISPR/Cas系统在遗传性视网膜疾病中的应用视网膜退行性疾病进展不可逆转，且视网膜再生潜能小，如何治疗视网膜退行性疾病成为了研究者们面临的重要挑战。遗传性视网膜退行性疾病具有不同临床表现和不同的基因突变形式，晚期由于渐进性光感受器死亡而最终出现不可逆转的失明。目前患有遗传性视网膜疾病的患者约有2000万人，还没有接受可靠有效的治疗。随着基因编辑技术的发展，基因和细胞治疗有望为这类疾病提供新的治疗前景[7]。迄今为止，已经发现有250个基因与视网膜退行性疾病的发展相关。利用CRISPR/Cas系统可以对这类疾病的相关基因进行前沿性研究[5]。

2.1.1CRISPR/Cas系统在Leber先天性黑矇的应用Leber先天性黑矇(Leber congenital amaurosis，LCA)是一种遗传性视网膜营养不良性疾病，于150a前被Theodor Leber首次报道。LCA主要表现为在出生时或出生后不久即出现视力丧失，钟摆样的眼球震颤，瞳孔黑矇及色素性视网膜变性[7]，其患病率约为1/3000，约占所有遗传性视网膜营养不良的5%。

LCA患者最常发生突变的基因是中心体蛋白290 kDa(CEP290)基因，这种突变基因引起的LCA被称为LCA10[8]。在CEP290突变中，最常见的是内含子26的突变(也称为IVS26突变)。Ruan 等[8]应用CRISPR/Cas9系统将CEP290剪接突变引入到293FT细胞，构建了模拟LCA10的细胞模型。并且通过特定的sgRNAs和Cas9的组合切除CEP290基因中的IVS26突变，发现可以有效地纠正LCA细胞模型中的IVS26突变。并通过构建动物模型，发现sgRNA和SpCas9的组合可以敲除小鼠中突变的CEP290基因。研究者还开发了限制SpCas9表达的自限性CRISPR/Cas9系统，发现该系统仍能诱导CEP290的靶向缺失，同时降低了脱靶效应并提高了系统的安全性。这些研究结果为今后应用CRISPR/Cas9系统治疗此类疾病带来了新的希望。

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)具有替代自体细胞的潜能。但是，对于许多遗传性疾病的治疗可能需要移植前的基因修饰。Burnight 等[9]通过CRISPR/Cas9介导的非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)切除了LCA10患者iPSCs中致病基因的IVS26突变，完成了iPSCs中的转录物和蛋白质的校正。因此Burnight 等认为CRISPR/Cas9系统可以用来纠正遗传性视网膜变性的多种遗传变异。

2.1.2CRISPR/Cas系统在视网膜色素变性中的应用视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是一种视网膜退化性疾病，常伴有夜盲症、管状视力、致盲等表现，具有高遗传性和异质性，发病率约1/4000，并且正在成为世界范围内不可逆失明的重要原因。目前已明确70余种基因与这种具有不同表型的视网膜退化性疾病相关[7，10]。

前体信使RNA(pre-mRNA)剪接是真核细胞中必不可少的生物学过程。许多剪接体基因中的遗传突变引起人眼相关疾病。Pre-mRNA剪接因子——RP9的突变易导致常染色体显性遗传视网膜色素变性(autosomal dominant retinitis pigmentosa,adRP)。Lv等[10]利用CRISPR/Cas9系统在体外进行Rp9基因敲除(KO)和点突变敲入(KI)，通过MTT方法，发现Rp9-KI和Rp9-KO细胞生长速率降低。通过western blot法发现Rp9-KI和Rp9-KO细胞增殖被抑制。通过体外划痕实验发现Rp9-KI和Rp9-KO细胞迁移减少。通过RNA-Seq的基因表达谱分析证明RP相关基因Bbs2和Fscn2在Rp9-KI和Rp9-KO细胞中显著下调。并通过RT-PCR方法发现，Rp9-KI和Rp9-KO不影响Bbs2剪接，但Fscn2基因的Pre-mRNA剪接明显受到影响。这表明并非所有的剪接都对Rp9突变同样敏感。这些研究结果揭示了RP9表达和疾病特异性基因之间的功能关系，并提供了RP9相关性RP疾病机制的新见解。

大多数adRP患者具有视紫红质RhoS334基因突变[11]。Bakondi等[12]在携带RhoS334ter突变的adRP大鼠模型中，通过电转染在视网膜下注射gRNA/Cas9质粒，进而选择性地将携带RhoS334ter突变的视紫红质基因删除。免疫组化显示表型改变是显而易见的，表现为感光突触和视网膜突触的保存。这表明这一策略可阻止视网膜退化，改善视觉功能。

2.2CRISPR/Cas系统在新生血管性疾病中应用血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在血管生成中起着关键作用，与多种人类疾病相关，如增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)和年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)等。PVR是目前工作年龄人群中获得性失明发生率最高的疾病，而ARMD是65岁以上人群失明的主要原因[13]。尽管抗VEGF药物可以减少新生血管的生长并减少血管渗漏，但是由于VEGF会持续从病变的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)分泌，这些抗VEGF药物必须多次注射[14]。而基因治疗因其长效表达会减少或消除对患者重复注射抗-VEGF抑制剂的需要而具有优势[15]。

2.2.1CRISPR/Cas系统在ARMD中的应用ARMD的发病机制可能与RPE和Bruch膜之间形成的基底膜沉积有关，且涉及补体系统的激活。ARMD与EFEMP1相关性黄斑变性具有相似的临床特征，如基底膜沉积物和玻璃膜疣，EFEMP1相关性黄斑变性是由人包含EGF腓骨蛋白样胞外基质蛋白1(EFEMP1)中的显性p.R345W突变引起的。为了研究在ARMD中Bruch膜，RPE和补体之间的关系，Fernandez-Godino 等[16]应用CRISPR/Cas9系统设计了含有p.R345W突变的ARPE-19细胞,通过免疫染色及transwells方法，发现由p.R345W突变引起的细胞外基质(ECM)结构及组成的变化会导致RPE细胞产生补体激活和形成基底沉积。值得注意的是，当人胎儿RPE细胞在ARMD患者的Bruch膜上培养时，也观察到类似的反应，这表明通过异常ECM刺激补体激活是遗传性和年龄相关性黄斑变性的早期发病机制中的共同因素。这些研究使我们部分了解了黄斑变性的早期发病机制。

ARMD与VEGF基因的过度表达有关。其中VEGFA是血管生成中的重要因素，因此它是治疗ARMD的主要靶点。Kim 等[14]通过激光诱导产生含有脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的ARMD小鼠模型，并将预先组装的VEGFA基因特异性Cas9核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)注射到小鼠视网膜下来研究Cas9 RNP是否可用于在ARMD小鼠模型中治疗CNV。他们发现在小鼠模型中，Cas9 RNP可以有效地减少CNV的面积，且通过Digenome-seq进行全基因组分析表明，在基因组中很少诱导脱靶突变。这些研究结果表明,可使用Cas9 RNPs靶向灭活视网膜中的VEGFA，用于ARMD的局部治疗。并且他们认为，基因治疗不仅是一个设想，在不久的将来医生可以运用基因治疗来治疗疾病。

2.2.2CRISPR/Cas系统在PVR中的应用小鼠双微体2(MDM2)是一种E3泛素蛋白连接酶，研究表明MDM2 SNP309G与PVR相关[17]，但MDM2 SNP309G是否参与PVR的发展尚不清楚。Zhou 等[18]应用CRISPR/Cas9系统及含有MDM2 G309的DNA模板构建表达MDM2T309G或T309T的hRPE细胞模型，并向兔眼玻璃体腔内注射表达MDM2 T309G或T309T的hRPE细胞。Western印迹分析表明表达MDM2T309G的细胞中p53含量较表达MDM2T309T的细胞明显降低。此外，与兔眼玻璃体腔内表达MDM2T309T的hRPE细胞相比， 表达MDM2T309G的hRPE细胞收缩显著增强，并且hRPE细胞中的MDM2T309G增强了兔模型中PVR的发展。实验结果表明RPE细胞中的MDM2 SNP309可能增强PVR发病几率。

2.3CRISPR/Cas系统在眼科其他人眼相关疾病中的应用

2.3.1CRISPR/Cas系统在眼部发育中的应用Pax6是一种含同源结构域的转录因子，对于大多数动物(包括果蝇、小鼠和人供体类)以及胰腺内分泌细胞的神经发育，以及分化中的眼睛及鼻腔发育至关重要。已有研究结果表明，Pax6突变的影响取决于突变的程度和基因剂量。为了证明不同剂量的Pax6基因对眼睛的影响，Yasue 等[19]应用CRISPR/Cas9系统建立了Pax6基因缺陷的小鼠模型。形态学和基因组分析表明，经Pax6-CRISPR编辑的具有不同的Pax6突变剂量的胚胎具有不同的眼睛表型。实验结果表明Pax6的中度表达可能导致视网膜过度增殖，且来自表面外胚层的晶状体发育比来自视泡囊的视网膜发育需要更高的Pax6基因剂量。这提示CRISPR/Cas9系统可控制小鼠模型中的基因剂量，为眼睛发育相关研究提供了方向。

2.3.2CRISPR/Cas系统在原发性开角型青光眼中的应用原发性开角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG)是全球不可逆转的视力丧失的首要原因，Myocilin(MYOC)突变可见于4%的POAG患者。研究表明MYOC突变导致蛋白质错误折叠，使小梁中的内质网应激，从而导致眼压升高，引起POAG。Jain 等[20]应用CRISPR/Cas9系统编辑小鼠小梁网细胞并构建了小鼠MYOC突变株，进而选择性地将MYOC突变删除。实验结果证明通过这项基因编辑技术可以降低眼压，证明了这项基因编辑技术在眼科这项重要疾病中的可行性。

2.3.3CRISPR/Cas系统在先天性白内障中的应用先天性白内障会导致新生儿双眼盲，之前研究表明有近1/3的先天性白内障与晶体基因突变相关，如aA-晶体蛋白基因(CRYAA)。Yuan 等[21]通过向兔受精卵的细胞质中注射Cas9 mRNA和sgRNA，人工构建CRYAA突变的兔模型，表现为先天性白内障、小眼球与早期晶状体萎缩以及晶状体纤维分化失败。因此，利用CRISPR/Cas构建的兔模型为进一步阐明CRYAA基因的致病机制提供了良好工具。

3展望

CRISPR/Cas9系统作为一种快速发展的革命性技术，在基因编辑方面展现出巨大的潜力，已有大量报道表示CRISPR/Cas9系统可以精确敲除、插入或替换细胞水平的目标基因，甚至可以用来构建动物模型。与其他基因组定位编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统具有更高效的基因编辑效率，操作更方便，同时安全性高，毒性小，脱靶效应相对较低。

虽然CRISPR/Cas系统具有良好的前景，但如何将该系统的各个组分直接高效地运输到细胞中仍是一个不小的挑战。目前，Rubul等[22]通过将金纳米颗粒与Cas9蛋白及sgRNA组成复合体，成功实现了CRISPR/Cas系统向细胞质及细胞核的转运，在细胞中实现了高达90%的运输效率。

此外，CRISPR的最新研究进展是寻求一种手段来导致单核苷酸的改变[23-24]。这一改变通过将去活化的Cas核酸酶(dead Cas，dCas)与啮齿动物胞嘧啶脱氨酶融合来实现。dCas /脱氨酶融合蛋白转染的细胞经历单个胞嘧啶至尿嘧啶的转化，随后通过DNA校正机制或在复制过程中将其修复为胸腺嘧啶。该系统整体效率的提高及插入错误的减少代表了CRISPR技术的巨大进步和发展[15]。

CRISPR/Cas9系统目前已被应用于动物遗传性疾病的治疗，同时也正在推进用于临床上治疗人类疾病。尽管与传统基因编辑技术相比具有明显优势，但围绕CRISPR/Cas系统的技术问题和伦理问题阻碍了其临床使用[25]。

第一个存在的问题是脱靶效应。与小鼠及斑马鱼相比，人类细胞中脱靶突变存在更常见[25-26]。最近，开发了一种可逆的基于CRISPR的基因编辑策略，称为CRISPR干扰(CRISPRi)。该技术对sgRNA与靶序列之间的错配高度敏感，因此与常规使用的RNAi相比减少了靶向脱靶效应[15]。此外，目前也采用了诸如sgRNA设计的优化，成对的nCas9的使用，配对的dCas9-FokI核酸酶和增强的Sp-Cas9的方法来解决脱靶问题[27-28]。然而，仍然存在一个问题：脱靶效应是否能够针对数十亿个DNA序列中涉及大量细胞的单一位点进行治疗，并且是针对个体患者进行特异性和不同设计的治疗[25]。

此外，使用CRISPR来编辑人类种系已引起科学界的伦理争论。例如，应用CRISPR技术可使运动表现或智力能力提高，如果只有特定的个人能够获得这种提高，就会造成社会问题[21]。

由于许多人眼相关疾病的病因尚未完全阐明且无有效的治疗方法，因而严重影响患者的生活质量。虽然目前围绕CRISPR/Cas系统仍存在很多问题，但随着技术的进一步完善，针对伦理问题等相关政策的进一步建立，CRISPR/Cas系统在人眼相关疾病中的前景十分可期。