甲醛对Hep G2细胞游离胆固醇代谢的影响

姜雪霞，王 盼，刘艳飞，张 艳，白剑英*

（山西医科大学公共卫生学院环卫教研室，山西太原 030001）

甲醛是一种室温下具有刺激性气味的无色气体，属高分子有机化合物，极易溶于水、醇和其他有机溶剂[1]。甲醛被广泛用于医疗固定剂、洗涤剂、化妆品、食品、橡胶、化肥、木材、皮革及纺织品等各种消费性产品[2]。随着甲醛的广泛应用，人类对甲醛污染的关注也逐渐增加。甲醛具有高活性，可与蛋白质、核酸等生物大分子反应[3]。大量研究证实甲醛具有中枢神经系统毒性、免疫系统毒性、生殖系统毒性及心血管系统毒性等[4]。与许多外源物质一样，甲醛进入机体后也需在肝脏进行代谢解毒。动物实验和体外实验证实甲醛可引起肝细胞形态改变，脂质过氧化反应[5-6]，提示甲醛具有一定的肝脏损伤作用。肝脏是胆固醇代谢的主要场所，肝脏受损的早期表现是脂质代谢紊乱，而胆固醇代谢紊乱又与多种疾病的发生发展相关联[7]。近年来越来越多的证据将肝脏中胆固醇平衡的改变和游离胆固醇（free cholesterol，FC）积累与非酒精性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）联系在一起[8-9]。本实验选择人肝癌细胞株HepG2细胞作为研究对象，探究甲醛能否引起肝细胞游离胆固醇的积累及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人肝癌细胞株HepG2细胞，购自中国科学院上海细胞生物研究所。

1.2 主要仪器及试剂

二氧化碳培养箱Galaxy 170S，购自德国Eppendorf公司；倒置显微镜BX51，购自日本Olympus公司；酶标仪Model 680，购自美国Bio-rad公司；电泳槽及电泳仪，均购自北京六一仪器厂；氮吹仪YGC-96，购自中国成都雅源科技有限公司。

甲醛（质量分数为37%）购自美国Sigma公司；DMEM高糖培养基，购自美国Hyclone公司；新生牛血清，购自杭州四季青生物工程材料有限公司；E1006游离胆固醇酶法测定试剂盒，购自北京普利莱基因技术有限公司；兔抗人固醇元件结合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2，SREBP-2）多克隆抗体，购自美国Abcam公司；兔抗人羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶 （hydroxy mothylglutaryl coenzyme A reductase，HMGCR）多克隆抗体，购自美国Bioworld公司；兔抗人低密度脂蛋白受体（lowdensity lipoprotein receptor，LDLR）多克隆抗体，购自美国Protein Tech公司；兔抗人胆固醇酰基转移酶（acyl coenzyme A-cholesterol acyltransferase，ACAT）多克隆抗体，购自美国Epitomics公司；BCA蛋白定量试剂盒，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠及羊抗兔二抗、β-actin抗体，均购自武汉Boster公司；ECL化学发光液，购自美国Thermo公司；甲醛染毒液的配制：准确吸取一定量的甲醛原液，用含10%小牛血清的完全培养基将其配制成浓度为12.5 mmol/L甲醛溶液，然后按梯度稀释至所需要的浓度，现配现用。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 将HepG2细胞培养在含有10%小牛血清的完全培养基中，放置于37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中，隔天换液，选取对数生长期的细胞进行后续实验。

1.3.2 实验分组 根据前期细胞毒性试验结果[10]，实验分为6组，分别是阴性对照组（完全培养基），甲醛处理组（0.004、0.02、0.1 mmol/L），两个阳性对照组即1 mmol/L 油酸（oleic acid，OA）和2.5 μg/mL布雷非德菌素A （brefeldin A，BFA）。

1.3.3 肝细胞内FC的测定 选取对数生长期的细胞接种于6孔板中，置于培养箱中。待细胞长至75%～80%，按上述分组进行处理，每组设置6个平行样，分别处理24和48 h后，用PBS清洗1次，每孔加750 μL的0.25%胰蛋白酶，镜下观察，细胞呈现皱缩时吸弃胰蛋白酶，向每孔加500μL PBS，轻轻吹打成单细胞悬液，分别取250μL的细胞悬液分装于两个EP管中。取250μL细胞悬液加入含有2 mL的异丙醇-己烷-水（体积比为80∶20∶2）中，充分混匀，室温下避光放置30 min，然后加入500μL己烷-乙醚（体积比为1∶1），充分混匀，室温避光孵育10 min，最后加入1 mL蒸馏水，充分混匀，室温避光孵育20 min，直至水相和有机相分离。吸取400μL上层有机相于标记好的玻璃管中，用氮吹仪吹干，然后采用甘油磷酸氧化酶法（GPO-POD）分析各组FC含量。另取250μL细胞悬液用BCA法进行蛋白定量。

1.3.4 Western blot检测胆固醇代谢相关蛋白的表达 细胞处理同1.3.3，每组设置3个平行样。染毒结束后，用PBS清洗2次，然后向每孔加入200μL上样缓冲液，收集蛋白并用BCA法进行蛋白定量。用聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白，浓缩胶为5%，分离胶10%，上样量为20μg，80 V电压电泳90 min。用湿转移法（400 mA，90 min）将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上；用含5%脱脂奶粉的PBST（含吐温20的PBS）室温封闭1 h；分别加一抗（SREBP-2、HMGCR、ACAT、LDLR和β-actin，均为1∶1 000稀释）4℃过夜；次日用PBST漂洗3次，每次10 min；用辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1 h，再用PBST清洗3次，每次10 min；加ECL发光液作用3 min后曝光，胶片于暗室中显影并定影，并用HPG4050惠普扫描仪对胶片进行扫描，最后采用Image-Pro Plus 6.0软件进行蛋白条带的半定量分析。

1.4 统计学分析

实验结果均用xˉ±s表示，采用SPSS 22.0软件进行统计分析。多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析（One way ANOVA）。进一步进行组间两两比较，若方差齐，采用LSD检验；若方差不齐，采用Games-Howell检验。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 甲醛对Hep G2细胞内FC含量的影响

如图1所示，与阴性对照组相比，各组FA染毒24 h，肝细胞内 FC 含量明显增加（P＜0.05）；0.02 和0.1 mmol/L FA染毒48 h后，肝细胞内FC含量显著升高（P＜0.05）。

2.2 甲醛对HepG2细胞胆固醇合成途径相关蛋白SREBP-2和HMGCR表达的影响

由图2可知，与阴性对照组相比，染毒24 h后，N-SREBP-2（即SREBP-2的活性形式）蛋白表达在不同浓度FA组和OA组无明显变化，仅在BFA组升高（P＜0.05）；而染毒48 h后，N-SREBP-2的表达水平仅在0.1 mmol/L FA组明显降低（P＜0.05）。HMGCR蛋白表达水平在染毒24 h和48 h后均高于阴性对照组（P＜0.05）。提示FA通过诱导HMGCR蛋白的表达以增加肝细胞内胆固醇的合成。

图1 不同浓度的甲醛对肝细胞内游离胆固醇含量的影响

图2 不同浓度的甲醛对肝细胞SREBP-2和HMGCR蛋白表达的影响

2.3 甲醛对Hep G2细胞胆固醇酯化相关蛋白ACAT表达的影响

Western blot结果显示（图3），FA染毒24 h后，各处理组ACAT蛋白表达水平均低于阴性对照组（P＜0.05）；在染毒48 h后，ACAT蛋白表达水平在0.02和0.1 mmol/L FA 组明显降低（P＜0.05），而在 OA 组和BFA组明显增加（P＜0.05）。提示FA可通过降低ACAT蛋白的表达水平，从而减少胆固醇酯的生成，促使胞内FC水平增加，可能会加重其对肝细胞的毒性作用。

图3 不同浓度的甲醛对肝细胞ACAT蛋白表达的影响

2.4 甲醛对Hep G2细胞重摄取途径相关蛋白LDLR表达的影响

Western blot结果显示（图4），与阴性对照组相比，FA染毒24 h后，除BFA组外，LDLR蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05）；染毒48 h后，HepG2细胞内LDLR蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。提示FA染毒后，肝细胞对胞外低密度脂蛋白重摄取减少。

图4 不同浓度的甲醛对肝细胞LDLR蛋白表达的影响

3 讨论

甲醛是一种广泛存在的环境污染物，除可引起眼、鼻、咽等部位的刺激及不适感，还具有致敏毒性及致畸作用，甚至会造成全身性疾病[11]。基于其可引起鼻咽癌和白血病，甲醛被世界卫生组织列为人类致癌物[12]。甲醛代谢所需要的酶广泛存在于肝脏中，使得甲醛在肝细胞中可迅速代谢为甲酸，并进一步氧化为二氧化碳排出体外，这个过程伴随一定量的氧自由基产生（ROS）[3，13]。有报道指出随着甲醛染毒浓度的增加，小鼠肝脏组织病理学损伤程度亦加重，表现为细胞水肿，细胞变性甚至细胞坏死，且肝损伤程度呈现剂量依赖性[14]，这提示甲醛具有肝脏损伤作用。而本课题组前期实验也证实，当甲醛浓度达到一定水平时，随着染毒剂量的增加，其对HepG2细胞活性抑制作用明显增加[10]，提示高浓度的甲醛对肝细胞具有直接损伤作用。

本实验发现FA处理HepG2细胞24 h后，肝细胞内FC含量明显增加；且延长作用时间至48 h后，0.02和0.1 mmol/L FA仍可使HepG2细胞内FC含量明显增加。说明甲醛可引起HepG2细胞游离胆固醇的积累，诱发肝细胞内胆固醇代谢的紊乱进而加剧了对肝细胞的损伤程度。肝细胞内胆固醇平衡的维持与胆固醇的从头合成、从血液中的重摄取及转运到血液和胆汁等多种途径相关[15]，而这些途径受阻很可能造成胆固醇在肝细胞内的代谢紊乱。

SREBP-2是肝脏胆固醇代谢的关键调控因子，它在内质网上以无活性的蛋白质前体存在，当细胞内胆固醇缺乏时，SREBP-2在SREBP裂解激活蛋白护送下进入高尔基体进行两步有效剪切，释放出具有转录活性的片段即N-SREBP-2，后者可迁移至细胞核，上调胆固醇合成的关键酶系，如HMGCoA合成酶及HMGCR等基因的表达，从而促进细胞内胆固醇的合成[16-17]；然而细胞内高水平的胆固醇又可反馈性抑制N-SREBP-2活性[18]。HMGCR是SREBP-2主要的靶基因，在肝脏中表达最高[19]，它是细胞内胆固醇合成过程中最关键的限速酶，其活性增加可使肝脏内胆固醇合成增多[20]。本实验发现甲醛染毒24 h后，NSREBP-2蛋白表达水平在HepG2细胞内无明显变化，而染毒48 h，N-SREBP-2蛋白表达水平在0.1 mmol/L FA染毒组明显降低，我们推测这可能与胞内高浓度胆固醇对SREBP-2的负反馈调节有关；而HMGCR蛋白表达水平在甲醛染毒24和48 h后均明显增加，且伴随着胞内FC的增加，说明甲醛可通过上调胆固醇合成关键蛋白HMGCR的表达来增加胞内胆固醇的合成。由上述结果可见，本实验中HMGCR蛋白表达水平的改变与SREBP-2蛋白表达水平的改变并不一致，说明HMGCR蛋白表达水平的增加并不是经由SREBP-2途径，这可能与HMGCR基因有多个启动子在多个转录起始位点起作用有关。有报道提示在培养的细胞中，SREBP-1a和SREBP-2同时参与调节胆固醇合成的有关基因[21-22]。我们推测甲醛有可能通过影响其他调控因子来上调HMGCR蛋白的表达进而增加FC的含量。

ACAT是细胞内唯一催化FC与长链脂肪酸形成胆固醇酯的酶，细胞中FC过度积累可形成胆固醇结晶，并对细胞产生毒性，ACAT的主要功能是防止游离胆固醇的过度产生，减少对细胞的脂毒性[23]。在体内或体外的完整细胞中，抑制ACAT的活性可通过增加FC和降低胆固醇酯的含量以达到细胞中胆固醇的重新分布[24]。本实验发现FA染毒24 h或0.02和0.1 mmol/L FA染毒48 h后，均可使HepG2细胞内ACAT的蛋白表达水平明显降低。本结果提示甲醛可通过降低ACAT的表达，减少胆固醇酯的形成，从而引起FC的积累，加重了对肝细胞的毒性作用。

细胞内胆固醇除自身合成外，还来源于细胞外脂蛋白的吸收[25]。LDLR可特异性识别LDL颗粒的apoB-100，将LDL递送到细胞中，再与溶酶体融合，其中胆固醇酯水解为FC和脂肪酸，增加胞内FC含量[26]；而当胞内游离胆固醇浓度增加时，肝脏又通过抑制LDLR合成，减少LDL重摄取，防止胆固醇在细胞内过度积累[27]。本研究发现FA染毒24和48 h后，LDLR蛋白表达水平均明显降低，抑制肝细胞对胞外LDL重摄取，从而限制了FC在肝细胞内过度积累，这可能与细胞内高浓度的FC对其进行负反馈调节有关。

综上可知，甲醛引起HepG2细胞内FC积累，可能与HMGCR表达上调导致胆固醇从头合成增加有关；也可能与胆固醇酯化蛋白ACAT表达下调降低酯化水平有关联。但在本实验剂量范围内，肝细胞仍有一定的代偿能力，可反馈性抑制LDLR蛋白的表达，这在一定程度上限制肝细胞内FC进一步增加。但目前对甲醛引起肝细胞内FC代谢异常关注仍较少，对于甲醛如何引起肝细胞内FC水平增加，仍需要进一步研究。