细胞壁降解酶在植物病原黄单胞菌致病性中的作用研究进展*

郭 威， 高思涵， 孙楚韵， 方 洁， 卢娉婷， 戴潇雨， 苏如意

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

0 引 言

黄单胞菌属(Xanthomonasspp.)细菌是自然界中普遍存在的一类革兰氏阴性植物病原细菌，其引起的植物病害遍布全世界.据统计，它们可侵染124种单子叶植物和268种双子叶植物，其中包括重要粮食作物和经济作物，如水稻、棉花、大豆、柑橘、香蕉、辣椒、甘蓝等[1-2].在温暖潮湿的条件下，黄单胞菌可通过水孔、气孔或伤口等部位侵入植物的不同器官，引发维管束萎蔫、溃疡、黑腐、叶枯、叶斑或果斑等多种类型的植物病害，从而导致重大减产和经济损失[3-4].

黄单胞菌侵染寄主植物过程可分为4个阶段：接触期、侵入期、潜育期和显症期[5-6].侵染初期，黄单胞菌附着在寄主植物表面，利用有限的营养生长繁殖[7].当病原菌种群密度达到某一阈值时，通过群体感应(quorum sensing，QS)机制释放大量的细胞壁降解酶(cell-wall degrading enzymes，CWDEs)，如纤维素酶、蛋白酶、内切-β-甘露聚糖酶、果胶酶、脂肪酶/酯酶、α-淀粉酶、木聚糖酶等，降解植物细胞壁，形成伤口以利于病原菌侵入植物体内[3，6].进入植物体内后，黄单胞菌通过相同的QS机制调控毒性相关基因的表达，以适应寄主体内环境；同时分泌大量的CWDEs，降解植物薄壁细胞/维管束，以利于病原菌获取大量繁殖所需营养，并定殖到植物体内，最终导致植物病害症状的产生[8-9].自20世纪70年代首次报道利用蛋白酶活性评价稻黄单胞菌株毒性指标以来，随后近半个世纪里，各国植物病理工作者就CWDEs的鉴定，以及CWDEs在黄单胞菌与寄主植物互作中的致病性及诱导抗病性作用等进行了大量研究.笔者将详细综述植物病原黄单胞菌中已鉴定的CWDEs的生物学功能，以及CWDEs在寄主植物上的致病性和诱导抗病性作用.

1 植物病原黄单胞菌的Ⅱ型分泌系统

Ⅱ型分泌系统(type Ⅱ secretion system，T2SS)在植物及动物致病细菌中普遍存在，并被广泛研究[10].病原菌Ⅱ型分泌蛋白(type Ⅱ secretion effectors，T2SEs)分泌至胞外需要2个步骤，首先通过Sec途径(sec-dependent pathway)或双精氨酸转运途径(twin-arginine translocation pathway，Tat)转运穿过细胞质内膜，释放到外周胞质间隙[11]；然后，再借助T2SS将外泌蛋白从外周胞质间隙跨越外膜转运至细胞表面或外部环境[11-12].通过T2SS，植物病原黄单胞菌将大量CWDEs、毒素等扩散至胞外，破坏或消解寄主植物抗侵染机械屏障，帮助病原菌适应并定殖到植物细胞内，从而引起组织坏死和病害[3-4].

植物病原黄单胞菌拥有2套T2SS，由11个xps基因编码的Xps系统和由12个xcs基因编码的Xcs系统组成[13].在辣椒斑点病菌(Xanthomonascampestrispv.vesicatoria，Xcv)中，Xps系统突变后，菌株的CWDEs活性几乎全部减弱，但并不完全丧失；Xcs系统突变后，菌株的CWDEs活性及致病力并无影响，但xcs基因可以互补Xps系统中对应同源基因的表型[14].这表明，Xps系统可能是黄单胞菌主要的T2SS；Xps与Xcs两系统间具有一定的功能冗余或叠加.XpsD是T2SS外膜上的重要组分，起着分子伴侣作用，野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestrispv.campestris，Xcc)的CWDEs需与其互作方可分泌至胞外[10].XcsD是否也具有分子伴侣的功能，与CWDEs互作以促进其外泌，目前尚不明确.

2 细胞壁降解酶在植物病原黄单胞菌致病性中的作用

由T2SS分泌的CWDEs在植物病原黄单胞菌致病进程中起着重要作用，它能瓦解由植物细胞壁构筑的防御病原菌入侵的第一道机械屏障；同时能提供病原菌迅速繁殖所需养分，从而促进病害症状的发展[3,6],甚至有些CWDEs自身就是致病因子[12,15-16].一种植物病原黄单胞菌能分泌多种CWDEs，具有多样性.不同植物病原黄单胞菌所分泌的CWDEs也因菌株而异，具有特异性.在植物病原黄单胞菌致病进程中，不同CWDEs需相互协作，具有协同性[17].

2.1 纤维素酶

纤维素酶是植物病原黄单胞菌分泌的,最重要的一类CWDEs，在破坏植物细胞促进病原菌完成寄生性与致病性等方面起着重要作用.然而，目前有关植物病原黄单胞菌纤维素酶的研究，仅局限于少数几个菌株.2001年，Schröter等[18]从XccNRLLB-1459菌株中鉴定出2个胞外纤维素酶基因engXCA(同源于KACC10331XOO4019)与engXCB(Xoo无同源基因)，engXCB基因对菌株的胞外纤维素酶活性贡献率仅8%，而engXCA/engXCB基因双突变后，病原菌的胞外纤维素酶活性相对于野生型减弱5倍.2007年，Hu等[19]利用大肠杆菌(BL21/DE3)系统异位表达白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)PXO99A菌株的纤维素酶基因eglXoB(同源于KACC10331XOO0282)，在BL21/DE3菌株胞内能检测到明显的纤维素酶活性，eglXoB基因突变后致使病原菌毒性相对于野生型减弱约87%.2007年，Jha等[20]从XooBXO43菌株中鉴定出2个胞外纤维素酶：ClsA(同源于KACC10331 XOO4019)与CbsA(同源于KACC10331 XOO4035)，clsA或cbsA基因单突变后，其菌株的胞外纤维素酶活性相对于野生型显著减弱，并且显著削弱病原菌的毒性与生长能力.此外，2016年，Xia等[12]利用大肠杆菌(BL21/DE3)系统异位表达柑橘溃疡病菌(Xanthomonascitrisubsp.citri)的9个纤维素酶候选基因，从中鉴定出2个具有强烈纤维素酶活性的基因bglC3(同源于KACC10331XOO0283)与engXCA(同源于KACC10331XOO4019)；但是仅BglC3具有胞外纤维素酶活性，而EngXCA虽具有纤维素酶活性却不能泌出胞外.由此可知，胞外纤维素酶在不同植物病原黄单胞菌菌株中存在差异.此外有研究表明，大豆斑疹病菌(Xanthomonasaxonopodispv.glycines，Xag)也具有显著的胞外纤维素酶活性[21]，然而其胞外纤维素酶的编码基因、数量、致病性及其他生物学特性如何，尚不清楚.

2.2 蛋白酶

自1975年日本学者首次用胞外蛋白酶活性来评判稻黄单胞菌菌株毒性变异以来，胞外蛋白酶活性一直是水稻条斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，Xoc)菌株毒性评价的重要指标[22-23].植物病原黄单胞菌大部分菌株均具有胞外蛋白酶活性，然而有关蛋白酶的研究却少有报道.在Xcc8004菌株中，全基因组注释含有6个胞外蛋白酶基因，而PrtA(同源于Xac306 XAC0928)是其主要的胞外蛋白酶，prtA基因突变后，菌株的胞外蛋白酶活性几乎完全丧失，致病性相对于野生型也显著减弱[24].2012年，Zou等[16]从XocRS105菌株中鉴定出唯一的胞外蛋白酶EcpA(同源于Xac306 XAC2763)，ecpA突变后，菌株的蛋白酶活性完全丧失，致病性相对于野生型也显著减弱.然而，稻黄单胞菌另一致病变种XooPXO86，T7174及PXO99A菌株虽拥有同源性完全一致的ecpA基因，PXO86与T7174菌株具有显著的胞外蛋白酶活性[25]，而PXO99A菌株却并不具有胞外蛋白酶活性[16,26]，表明EcpA并不是所有Xoo菌株的胞外蛋白酶.2008年，Thowthampitak等[21]曾指出，Xag12-2菌株具有强烈的胞外蛋白酶活性，但未鉴定出具体的胞外蛋白酶基因.本课题组近期研究也发现，Xag另一菌株NEAU001也同样具有强烈的胞外蛋白酶活性，并从中共筛选出4个胞外蛋白酶，有趣的是，EcpA同源物并不在其中(未发表数据).由此可见，植物病原黄单胞菌的胞外蛋白酶很可能具有多样性或菌株特异性.

2.3 果胶酶

由带负电荷的酸性糖苷分子构成的果胶，是植物细胞壁的重要组成部分[27].果胶酶又称为聚半乳糖醛酸酶，是一种以裂解或消除作用切断果胶质中的糖苷键，并使果胶质裂解成为多聚半乳糖醛酸的复合酶[28].根据对果胶分子作用方式的不同，可将果胶酶分为三大类：解聚酶(催化果胶解聚)、酯酶(催化果胶酯键水解)和原果胶酶(催化原果胶解聚)[28].绝大多数的植物病原真菌和细菌均能分泌果胶酶，各种果胶酶分子相互协作，降解寄主植物的果胶聚合物，使细胞壁疏松，以帮助病原菌克服由果胶组成的机械屏障，从而造成寄主植物叶斑病、软腐病、枯萎病等症状[29].

在植物病原黄单胞菌中，有关果胶酶的研究也略有报道.2006年，Kaewnum等[30]从XagKU-P-34017菌株中鉴定出1个果胶裂解酶XagP(同源于KACC10331 XOO0821)，并证实XagP不仅是Xag果胶酶活性所必需的，而且还参与病原菌在非寄主烟草上过敏性反应(hypersensitive response，HR)的诱导.2008年，Wang等[15]从Xcc8004菌株中鉴定出2个果胶酶：PghA(同源于KACC10331 XOO3959)和PghB(同源于KACC10331 XOO2699)，并证实这2种酶是以依赖Xps的方式经由T2SS分泌.此外，pghA与pghB基因受HrpX，HrpG及全局性调控子Clp正调控；两基因双突变后，菌株的果胶酶活性降低70%，致病性相对于野生型也显著减弱.2016年，Tayi等[31]从白叶枯病菌XooBXO43菌株中鉴定出4个果胶酶：1个聚半乳糖醛酸酶PglA(同源于KACC10331 XOO2699)，1个果胶甲基酯酶Pmt(同源于KACC10331 XOO2696)和2个果胶裂解酶Pel(同源于KACC10331 XOO0821)与PelL(同源于KACC10331 XOO2265)，这4个果胶酶编码基因分别突变后，菌株的果胶酶活性明显降低，致病性相对于野生型也有所减弱.推断果胶酶在不同植物病原黄单胞菌中很可能具有高度的同源性，它们除了参与病原菌的果胶酶活性、致病性外，还很可能具有一些其他生物学特性.

2.4 内切-β-甘露聚糖酶

内切-β-甘露聚糖酶不但可以水解半纤维素多糖，如甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖、以及半乳葡甘露聚糖等的β-1,4-甘露糖骨架，而且还能通过松弛细胞壁来调控细胞伸长[32].内切-β-甘露聚糖酶普遍存在于动物、植物及微生物中，在植物病原黄单胞菌中更是尤为广泛.然而，相对于纤维素酶、蛋白酶及果胶酶等，有关内切-β-甘露聚糖酶的研究报道却相对较少.2003年，Dow等[33]从Xcc8004菌株中鉴定出1个内切-β-甘露聚糖酶ManA(同源于Xcv85-10 XCV1826)，研究发现，manA基因及其编码产物酶活性受DSF/rpf(diffusible signal factor，DSF/regulation of pathogenicity factors，rpf)系统正调控；manA基因突变后，菌株的内切-β-甘露聚糖酶活性完全丧失，并且病原菌的毒性及生长能力相对于野生型显著减弱；此外，还发现ManA能促使病原菌菌体由聚集态向游离态转化，是驱散生物膜形成的分散酶.2010年，Hsiao等[34]再次证实，ManA是XccXc17菌株中唯一的内切-β-甘露聚糖酶，manA基因突变后，菌株的甘露聚糖酶活性完全丧失；此外，还证实manA受刺槐豆胶(locust bean gum，LBG)诱导表达、并受RpfF及Clp正调控.2008年，Thowthampitak等[21]曾指出，Xag12-2菌株具有强烈的胞外内切-β-甘露聚糖酶活性，但并未鉴定出具体的甘露聚糖酶编码基因.推测ManA很可能是Xcc中唯一的内切-β-甘露聚糖酶，那么ManA是否也是其他植物病原黄单胞菌中主要或唯一的内切-β-甘露聚糖酶，是否对病原菌的致病性具有重要贡献，有待于进一步验证.

除了上述提到的CWDEs外，植物病原黄单胞菌还能分泌出脂肪酶/酯酶、α-淀粉酶、木聚糖酶等.但是，不同植物病原黄单胞菌分泌CWDEs的酶活性及种类因菌株而异，或者说具有菌株特异性，例如：Xcc菌株不能分泌木聚糖酶，部分Xoo菌株不能分泌蛋白酶，而Xoc与Xag菌株分泌的果胶酶量/活性极少.在黄单胞菌与寄主植物互作过程中，各种CWDEs相互协作，破坏植物细胞壁以促进病原菌在寄主植物上寄生与致病.与此同时，部分CWDEs本身就是黄单胞菌的毒性因子，在病原菌致病过程中起着重要作用.

3 植物病原黄单胞菌Ⅱ、Ⅲ型分泌系统相

互协作调控病原菌在寄主上的毒性由hrp-hrc-hpa基因簇编码的Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system，T3SS)是植物病原黄单胞菌中高度保守的、最重要的致病系统[35-36].通过T3SS，黄单胞菌将大量Ⅲ型效应蛋白(type Ⅲ secretion effectors，T3SEs)注入寄主细胞，抑制寄主先天免疫反应，从而促进病原菌在寄主植物上的寄生性与致病性[37-38].

由植物病原黄单胞菌T2SS分泌的CWDEs具有双重功能，一方面能降解植物细胞壁，引起或促进植物病害；另一方面能诱导植物防卫反应，如细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)、胼胝质沉积(callose deposition)等.2007年，Jha等[20]研究发现，体外表达纯化的XooBXO43菌株的纤维素酶(CbsA和ClsA)与脂肪酶/酯酶(LipA)均能诱导细胞壁相关的基础免疫，如PCD、胼胝质沉积等.2012年，Zou等[16]也发现，体外表达纯化的Xoc胞外蛋白酶EcpA也能诱导类似的植物防卫反应.2013年，Sinha等[38]采用农杆菌系统瞬时表达XooBXO43菌株的T3SEs方式，从15个候选T3SEs中筛选出4个能抑制LipA诱导的细胞壁相关基础免疫的效应蛋白，如XopN，XopQ，XopX和XopZ.2016年，Tayi等[39]首次报道，XooBXO43菌株的纤维素酶(CbsA和ClsA)和木聚糖酶(Xyn)在病原菌侵染过程中均能诱导细胞壁相关的基础免疫，而脂肪酶/酯酶(LipA)和果胶酶(PglA)在病原菌侵染过程中并不能诱导这种基础免疫.上文所引用的3位作者Jha，Sinha与Tayi均来自于印度学者Ramesh的课题组，该研究小组在植物病原黄单胞菌CWDEs诱导植物先天免疫反应领域作出了重要贡献.比较Jha与Tayi的论文可推测，在体外条件下植物病原黄单胞菌CWDEs均能诱导植物细胞壁相关的基础免疫，而在体内条件下CWDEs是否能诱导这种基础免疫很可能取决于自身分泌活性或量的大小.Ramesh研究组[39]指出，黄单胞菌CWDEs诱导的细胞壁相关的这种基础免疫，是源于CWDEs破坏寄主植物细胞壁而释放的损害相关分子(damage-associated molecular patterns，DAMPs)诱导植物产生的免疫反应.然而，目前为止，关于DAMPs的真实身份还一无所知.此外，关于能抑制CWDEs诱导先天免疫反应的T3SEs也知之甚少.

4 总结与展望

过去近半个世纪的研究工作充分证明，植物病原黄单胞菌CWDEs至少具有以下特点：1)具有多样性，一种植物病原黄单胞菌能分泌多种CWDEs；2)具有特异性，不同植物病原黄单胞菌所分泌的CWDEs因菌株而异；3)具有协同性，在植物病原黄单胞菌致病进程中，不同CWDEs需相互协作；4)具有双重功能，一方面能降解植物细胞壁，促进或引起植物病害；另一方面能诱导植物防卫反应，如PCD、胼胝质沉积等.然而这些研究工作主要集中在维管束病原菌Xcc与Xoo上，在其他植物病原黄单胞菌(如薄壁细胞病原菌Xag)上还鲜有报道.此外，在黄单胞菌CWDEs与寄主植物互作机制等方面，还有许多科学问题需要回答.因而，未来研究工作应包括以下方面：1)鉴定其他植物病原黄单胞菌的CWDEs，并揭示不同菌株CWDEs的差异性与多样性；2)全基因组内挖掘CWDEs诱导致使寄主植物显著变化的基因，特别是病程相关基因(pathogenesis-related genes)等；3)探究不同类CWDEs在诱导寄主植物先天免疫反应上，是否具有功能叠加或冗余，抑或具有协同作用；4)鉴定由CWDEs破坏寄主植物细胞壁而释放的DAMPs；5)筛选抑制CWDEs所诱导先天免疫反应的T3SEs，并揭示其抑制先天免疫反应的方式；6)探究参与CWDEs诱导先天免疫反应的受体、信号元件及转录因子等.在这些领域开展广泛的研究，无疑将促进对黄单胞菌与寄主植物互作机理更深入的理解，为植物细菌病害的生物防治策略开拓新的途径.