凤尾鱼酶解工艺优化及其产物促进嗜热链球菌增殖作用

胡凌豪,葛俊苗,宋益善,2,*,陈建康,盛 洁,3,李路瑶,金 礼,雷洲

(1.上海海洋大学食品学院,上海 201306;2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306;3.国家淡水水产品加工技术研发分中心(上海),上海 201306)

凤尾鱼(Anchovy),作为我国长江口的重要经济鱼类和捕捞对象之一,主要分布在东海河口[1]。凤尾鱼作为一种高蛋白低脂肪鱼类,除却必需氨基酸和风味氨基酸含量都高以外,还包括谷物中所缺乏的赖氨酸,且含量丰富。但作为一种低值水产品,除了罐头食品的制作[2],凤尾鱼在食品工业中的应用有限,对其高蛋白特性并未充分利用。

由于海洋和淡水水产资源丰富,具有高蛋白低脂肪的特性,且其本身就含有一些结构新颖、功能特异的活性多肽,因此已经成为了制备和获取多肽的主要来源之一[3]。同时,水产品源蛋白肽不仅具有蛋白质的营养特性,还有抑制血管紧张素转化酶、抗氧化、提高免疫、抑制酪氨酸酶、抗疲劳、抗衰老、抗肿瘤、保护胃黏膜及抗溃疡、抑制血小板凝结、促进骨形成作用、促进皮肤胶原代谢等多种功能活性[4]。

作为酸奶发酵剂之一的嗜热链球菌由于具有改善肠道功能、提高机体免疫能力、缓解乳糖不耐症等多种生理功效[5]而被乳制品工业广泛关注。对于嗜热链球菌的应用,一个重要指标是其可以大量的生长。然而,由于嗜热链球菌本身缺少蛋白水解酶,因此其增殖需要依靠外界环境中的肽[6]。相关研究表明,相比于大分子蛋白,寡肽以及游离氨基酸更容易被嗜热链球菌所利用,且嗜热链球菌对环境中的寡肽以及游离氨基酸的量有一定的要求[7]。

对于蛋白质酶解产物促进嗜热链球菌增殖效果的研究大都局限于大豆蛋白和乳蛋白酶解物等植物性蛋白肽[8-11]。然而对水产源蛋白肽促益生菌生长则鲜有报道。相比植物性蛋白肽,动物性蛋白肽具有自身的特点,如所含人体必需氨基酸种类齐全、各氨基酸的组成比例更合理等。同时,水产源蛋白肽具有易于提取以及成本低廉等特点[12],故可以用于促进嗜热链球菌增殖的研究。

因此,本课题组以凤尾鱼为研究对象并进行酶解,探讨凤尾鱼酶解产物对嗜热链球菌的增殖效果,通过响应面法对酶解工艺进行优化,并对不同分子量的酶解肽的促嗜热链球菌增殖作用进行了探索,同时对其抗氧化能力进行研究,以期为酸奶等多组分功能性食品的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

凤尾鱼 当地水产市场(中国上海);风味蛋白酶 酶活1.38×103U/g，日本天野酶制品株式会社;嗜热链球菌(CICC-20174) 中国工业微生物菌种保藏管理中心;其余所有化学试剂 AR，上海麦克林生化科技有限公司。

0.22 μm亲水针式滤器 购买自颇尔公司;3、10 kDa超滤管 购买自默克密理博;5 kDa超滤管 购买自赛多利斯公司;721G可见光分光光度计 上海精科上分有限公司;AUY120电子分析天平 台湾岛津科学仪器股份有限公司;HCJ-2B水浴恒温磁力搅拌器 常州中诚仪器制造有限公司;FD-1A-50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;YXQ-LX高压蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司;XZ-6G离心机 湘智离心机仪器有限公司;ZQLY-300恒温振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 凤尾鱼样品预处理 新鲜凤尾鱼放入鱼冰比为1∶1 (w/w)的冰盒中运送到实验室。将凤尾鱼流水洗净,去除内脏后绞碎混匀,直接使用-20 ℃贮藏备用。

1.2.2 凤尾鱼成分的分析 水分含量:5009.3-2016《食品中水分的测定》直接干燥法;蛋白质含量:GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法;脂肪含量:GB 5009.6-2016《食品中脂肪的测定》索氏抽提法;灰分含量:GB5009.4-2016《食品中灰分的测定》食品中总灰分的测定。以上实验均重复3次。

1.2.3 酶解方法 凤尾鱼酶解工艺优化参照Wang等人[13]的实验方法,并稍作修改。取出冻藏凤尾鱼鱼糜,流水解冻后,精确称量(2.000±0.0002) g凤尾鱼,加入定量的蒸馏水,沸水加热30 min使蛋白变性,冷却至50 ℃,使用0.1 mol/L磷酸和0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0±0.01,加入定量风味蛋白酶,反应一定的时间后,立即放入100 ℃水浴中加热10 min,灭酶。在4 ℃的条件下过滤,取滤液,冻干,获得蛋白酶解物(Anchovy Fish Hydrolysate,AFH)。

1.2.4 酶解单因素试验 在初始pH为7,酶解温度为50 ℃的条件下,考察酶解时间,料液比和加酶量这三个因素酶解凤尾鱼所得的肽对嗜热链球菌的增殖作用(ΔOD600)。按照1.2.3的方法酶解凤尾鱼,固定料液比为1∶3 g/mL、加酶量为4%的酶解条件下,考察酶解时间(1、2、3、4、5、6、7、8 h)对嗜热链球菌的增殖作用的影响;固定酶解时间为4 h、加酶量为4%的酶解条件下,考察料液比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶10、1∶15 g/mL)对嗜热链球菌的增殖作用的影响;固定酶解时间4 h、料液比1∶3 g/mL的酶解条件下,考察加酶量(1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%)对嗜热链球菌的增殖作用的影响。

1.2.5 响应面Box-Benhnken中心组合试验 在单因素实验结果的基础上,每个因素选取三个对嗜热链球菌的增殖作用的影响较大的水平,建立三因素三水平的Box-Benhnken中心组合试验,以嗜热链球菌的增殖作用为响应值,各因素的三个水平采用-1、0、1进行编码,设计见表1。

表1 响应面设计实验因素水平和编码Table 1 Independent variables and their levels used in the response surface design

1.2.6 对嗜热链球菌增殖作用的评价 用1 mL无菌生理盐水反复冲洗嗜热链球菌斜面培养基3次,收集菌液并混匀,作为嗜热链球菌种子液;分别取0.1 mL种子液加入5 mL无AFH合成培养液[14]及AFH合成培养液中,37 ℃ 160 r/min培养18 h,分别测其OD600值,嗜热链球菌增殖量计算入下:

ΔOD600=OD600a-OD600b

其中,ΔOD600为嗜热链球菌增殖量,OD600a为嗜热链球菌AFH合成培养液的吸光值,OD600b为嗜热链球菌合成培养液的吸光值。

1.2.7 酶解液中不同分子量多肽的分离及增殖作用评价 利用1.2.5最优酶解工艺对凤尾鱼进行酶解,将酶解滤液分别装入3、5、10 kDa超滤管中,4000 r/min离心30 min,获得4种不同分子量段的多肽液,分别冷冻干燥后,得到相对应的酶解肽(<3 kDa:AFH 1;3～5 kDa:AFH 2;5～10 kDa:AFH 3;>10 kDa:AFH 4)。向合成培养液中分别加入AFH 1、AFH 2、AFH 3、AFH 4,使其终浓度为1.0 g/L,获得4种不同AFH合成培养液。分别加入0.1 mL种子液37 ℃ 160 r/min培养18 h,分别测其ΔOD600值,以期获得增殖效果最优肽段。

1.2.8 最佳增值效果凤尾鱼酶解肽含量评价 向合成培养液中分别加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 g/L增殖效果最优蛋白酶解肽,获得11种不同最优AFH合成培养液。分别取0.1 mL种子液加入5 mL 11种不同最优AFH合成培养液中,37 ℃ 160 r/min 培养18 h,分别测其ΔOD600值,以确定最佳增值效果的蛋白酶解肽含量。

1.2.9 DPPH+·清除率的测定 DPPH+·清除率的测定参照MarijaLesjak等[15]的方法并稍作修改:用无水乙醇配制终浓度为 0.02 mol/L的DPPH+·乙醇溶液,取100 μL该溶液与100 μL不同浓度的酶解液(AFH水溶液和AFH 1水溶液,0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10 mg/mL),室温避光反应30 min并测定混合液的吸光度(A515),VC作为阳性对对照,IC50值通过Excel 2010计算获得。清除率计算公式为:

I(%)=(A0-A1)/A0× 100

其中：A0为以蒸馏水作为空白组的吸光度值，A1为样品溶液吸光度值。

1.3 数据处理

本研究实验采用Excel 2010做图与方差分析,Design-Expert 8.0.6软件进行方差及响应面分析。

2 结果与分析

2.1 凤尾鱼成分分析

对凤尾鱼进行成分分析,凤尾鱼整鱼(湿基)中蛋白的含量达到了20.56%±0.007%,水分含量为70.94%±0.033%,脂肪含量为3.94%±0.015%,灰分含量为2.38%±0.03%，具有高蛋白,低脂肪的特点。在本研究中,综合考虑实际应用中工业化生产操作步骤以及成本,在原材料预处理的过程中省略除脂的过程,通过后期过滤操作,将脂肪除去。

2.2 单因素实验

2.2.1 酶解时间对酶解产物促进嗜热链球菌增殖效果的影响 由图1可知,对嗜热链球菌的增殖效果随酶解时间的增加呈先增大后减小的趋势,酶解时间在5 h时,嗜热链球菌增殖效果达到最大值。Juillard等人[16-17]的研究表明,相对于游离氨基酸,嗜热链球菌更倾向于利用环境中的寡肽进行增殖。因此,推测可能的原因是随着时间的增加,更多的凤尾鱼蛋白被酶解为多肽,但当到达一定的时间后,随着原料的变少和多肽同时被酶解,体系中多肽含量有所降低[13]。由于5～6 h之间促嗜热链球菌增殖未显差异性,故在响应面研究中选择3、5、7 h作为考察因素。

图1 酶解时间对嗜热链球菌增殖作用的影响Fig.1 Effect of reaction time on the proliferation of Streptococcus thermophiles注:不同小写字母表示多重比较差异显著(p<0.05),图2、图3同。

2.2.2 料液比对酶解产物促进嗜热链球菌增殖效果的影响 料液比对嗜热链球菌增殖作用的影响可见图2。随着料液比逐渐降低,嗜热链球菌的增殖效果先增大,然后减小,在料液比为1∶2时增殖效果最佳。这可能是因为嗜热链球菌的增殖与肽含量有关,当料液比值较高的时候,不利于凤尾鱼和风味蛋白酶在溶液中的扩散,导致酶解时有效接触面积过低,不利于凤尾鱼蛋白酶解;而当料液比值较低时,凤尾鱼和风味蛋白酶在溶液中太过于分散,也会导致酶解时有效接触面积过低,不利于蛋白肽的生成[13],因此在响应面研究中选择1∶1、1∶2、1∶3 g/mL作为考察因素。

图2 料液比对嗜热链球菌增殖作用的影响Fig.2 Effect of the ratio of material to liquid on the proliferation of Streptococcus thermophiles

2.2.3 加酶量对酶解产物促进嗜热链球菌增殖效果的影响 加酶量对嗜热链球菌增殖作用的影响如图3所示,随着加酶量的增加,嗜热链球菌增殖效果先逐渐增大,然后降低,当加酶量达到5%时,嗜热链球菌增殖作用最大。其原因可能是在加酶量较低时,风味蛋白酶与凤尾鱼接触不充分,仅有一部分凤尾鱼蛋白酶解成为肽。但当酶过多的加入,使得肽进一步水解,促嗜热链球菌增殖作用降低[13]。由于4%、5%、6%促嗜热链球菌增殖未显差异性,故在响应面研究中选择3%、5%、7%作为考察因素。

图3 加酶量对嗜热链球菌增殖作用的影响Fig.3 Effect of enzyme concentration on the proliferation of Streptococcus thermophiles

2.3 响应面Box-Benhnken中心组合实验

2.3.1 响应面Box-Benhnken中心组合实验方案及结果 由单因素实验结果以及Design-Expert 8.0.6统计分析软件设计出的实验方案及实验结果如表2所示,以嗜热链球菌的增殖效果(ΔOD600)为响应值,以酶解时间(A)、料液比(B)和加酶量(C)为自变量,建立三因素三水平Box-Benhnken中心组合实验设计共包括17个实验方案,其中12个析因实验点,5个中心实验点,用以计算实验误差。

表2 响应面实验设计及嗜热链球菌的增殖效果Table 2 RSM design and theproliferation of Streptococcus thermophiles

2.3.2 回归方程拟合及方差分析 回归方程拟合及方差分析数据均由Design-Expert 8.0.6统计分析软件得出,分析结果见表3,对各因素回归拟合后,得到回归方程:

表3 回归模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

ΔOD600=-0.11A2-0.092B2-0.057C2-0.0025AB+0.00725AC+0.00825BC+0.04A+0.03B+0.019C+0.57

2.3.3 响应面曲线图分析 响应面曲线结果如图4所示,图4(a)～(c)分别为固定加酶量、料液比和酶解时间为0水平时,另外两个因素的交互作用对嗜热链球菌增殖作用的影响,由图可知,嗜热链球菌增殖作用随任意两个变量的增加呈上升趋势,当达到某一值时,曲面下降。(a)～(c)图中所显示的曲面陡峭程度相近,无法通过结果图判断哪两个因素之间的交互因素更为明显,同时方差结果也表明,任意两因素间对嗜热链球菌增殖作用的交互作用均不显著。

图4 两因素的交互作用对嗜热链球菌增殖的响应面图Fig.4 Response surface plots of variable parameters on the proliferation of Streptococcus thermophiles

2.3.4 确证实验 对回归方程求解,当嗜热链球菌增殖作用达到最大值ΔOD600=0.57时(A,B,C)=(0.19,0.17,0.19),即酶解时间为5.38 h,料液比为1∶2.17,加酶量为5.38%。为方便实际操作,将实验条件定为酶解时间5.4 h,料液比1∶2.2,加酶量5.4%,取凤尾鱼肉糜进行平行验证实验,五次平行实验得到的结果为0.556±0.017。经过确证实验表明,实际实验操作值与响应面拟合曲线所得的理论值基本相符,证明此酶解工艺获得的蛋白酶解产物可以有效的促进嗜热链球菌的增殖。

2.4 促进嗜热链球菌增殖最优分子量段的测定

促进嗜热链球菌增殖最优分子量段的测定结果如图5所示。可以看出,四个片段促嗜热链球菌增殖效果的顺序为:AFH 1>AFH 2>AFH 4>AFH 3。其中,AFH 1片段促进嗜热链球菌增殖效果明显高于其它片段,说明分子量低于3kDa的凤尾鱼源肽更适于促嗜热链球菌增殖,这与寡肽是乳酸菌生长主要氮源的观点相一致[6]。

图5 不同分子量段的酶解产物对嗜热链球菌增殖作用的影响Fig.5 Effect on Streptococcus thermophilesproliferated by fragments with different molecular weights

2.5 AFH1在培养基中最佳含量测定

AFH1在培养基中含量与促嗜热链球菌增殖效果的关系如图6所示。嗜热链球菌的促增殖效果随着AFH1的含量上升逐渐增大,当达到1.2 g/L后增幅平缓。其可能的原因在于AFH1含量较低时,环境中未能提供足够的嗜热链球菌生长所需的氮源,因此嗜热链球菌增殖效果低,随着酶解物含量上升到一定值后,环境所提供的氮源达到饱和,因此嗜热链球菌增殖趋于平缓。

图6 不同含量的酶解产物对嗜热链球菌增殖作用的影响Fig.6 Effect on Streptococcus thermophiles proliferated by growth media with different compositions of anchovy hydrolysate

2.6 DPPH·清除率测定结果

DPPH·乙醇溶液呈紫色,在515 nm处有强吸收,当体系中加入抗氧化性物质时,该物质能与DPPH+·单电子配对,吸收逐渐消失,进而评价清除剂的清除能力[18]。凤尾鱼酶解产物的DPPH+·清除率结果如图7所示,以VC作为对照,在浓度低于5 mg/mL的时候AFH1的DPPH·清除作用随浓度的增大呈递增趋势,大于5 mg/mL的时候AFH1的自由基清力趋于稳定,清除率达到70%。这结果与李雪等人[19]利用风胃蛋白酶酶解草鱼鱼皮对DPPH·清除率结果(77.3%)相似。AFH1的IC50值为2.73 mg/mL。与此同时,当AFH的浓度达到7 mg/mL时,DPPH·自由基清除作用趋于稳定,清除率达到60%,IC50值为3.18 mg/mL。结果表明凤尾鱼酶解产物有较好的DPPH·清除能力,且小于3 kDa的分段的多肽DPPH+·清除能力高于未分段的多肽。

图7 酶解产物对DPPH·清除作用Fig.7 DPPH radical-scavenging actives of anchovy hydrolysate

3 结论

采用响应面法对凤尾鱼酶解工艺促进嗜热链球菌增殖进行优化,建立了促进嗜热链球菌增殖的回归模型,由该模型优化的酶解工艺为:酶解时间5.4 h,料液比1∶2.2,加酶量5.4%。此条件下,平均促进嗜热链球菌增殖为0.556,与模型预测相近,进一步验证了改模型的可靠性。通过对不同分子量段的酶解产物促进嗜热链球菌增殖的结果表明,分子量小于3000 Da促进嗜热链球菌增殖效果最优,并且其在培养基中的含量最佳值为1.2 g/L。抗氧化活性实验结果表明,凤尾鱼酶解产物对DPPH·有一定的清除能力,说明具有较高的抗氧化活性。