酸水解法提取甘薯结合酚工艺优化

冯 悦,冯 颖

(沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳 110866)

多酚作为植物体内具有良好抗氧化性的功能成分[1-2],还具有延缓衰老、抗炎、抗病毒、抗辐射、护肝、抗癌和保护心血管等生物活性[3-4]。在植物原料中,除游离酚外,还有部分酚类物质是以与纤维素、果胶、蛋白等结合态的形式存在,这些酚类物质即结合酚[5]。结合酚在人体内经酶系水解转化为游离酚后被人体吸收,具有游离酚清除自由基、降血压等活性[6-7]。它不能被胃和小肠消化吸收,但可在结肠中释放并产生生物活性[8-9],相对于游离酚,结合酚类物质经肠道微生物菌群发酵作用后可能发挥更强的生物活性[10]。

目前关于植物多酚的研究报道主要停留在游离酚层面,因为以结合态形式存在,不能直接被有机溶剂萃取,因此结合酚常常被忽略,这不仅使所测定的植物多酚总量低于其实际值,而且也降低了植物多酚的实际应用价值。开展植物结合酚提取方法的研究,对于评价植物多酚的总量及进一步利用植物结合酚进行生物活性研究具有十分重要的意义,因此成为近年来植物多酚领域研究的一个焦点。结合酚提取方法有碱水解、酸水解、酶水解,以碱水解的数量最多,但没有确凿证据评定哪种方法更好[5]。其中,徐菲等[11]采用碱法和酸法提取青稞麸皮中结合酚,发现酸水解得到的多酚总量(325.104 mg/100 g)远远高于碱水解(115.382 mg/100 g)。张金宏等[12]采用碱水解、酸水解和单宁酶水解法提取苹果渣中结合酚,发现酶水解法和酸水解法比碱水解法更适合于提取苹果渣中结合酚,单体酚总量分别为179.444、255.266和152.264 μg/g。

甘薯薯块含有丰富的糖类、膳食纤维、蛋白质、矿物质等营养成分[13-15],同时还富含绿原酸[16-17]、花色苷[18]、黄酮[19]、多糖[20]等多酚活性物质而具有抗氧化、预防癌症、减少慢性疾病、降低血压、抗炎、抗菌等多种保健功能[21]。目前,关于甘薯结合酚提取工艺参数及其在不同品种中的含量分布情况缺乏,项目组前期曾采用碱水解法提取紫薯结合酚,考虑到碱水解法提取过程中需要辅助磁力搅拌不利于工业化生产,且碱水解法得到的紫薯结合酚提取液有一定粘度,流动性较差。因此,本研究以紫薯“辽薯20”为原料,采用酸水解法将其结合酚从原料组织中释放出来,进一步采用乙酸乙酯对其进行萃取,利用响应面法优化了结合酚的酸水解法提取工艺。在此基础上,对12个不同甘薯品种中的游离酚和结合酚进行了提取测定。开展该研究有利于开展不同品种甘薯中结合酚的提取并明确其含量,对进一步评估不同品种甘薯多酚的总量及选取适宜品种进行结合酚生物活性的研究具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验用甘薯品种 “辽薯20”、“辽薯26”、“辽薯28”、“辽薯30”、“辽薯33” 辽宁省农科院提供;“烟薯25”、“紫罗兰” 购自山东泰安;“红薯1号”、“红薯5号”、“粘地瓜”、“本地红”、“808” 购自大连庄河;无水乙醇、乙酸乙酯、硫酸、甲醇、福林酚试剂、氢氧化钠、碳酸钠 均为国产分析纯，沈阳化学试剂厂。

MP2002电子天平 上海舜宇恒科学仪器有限公司;350粉碎机 浙江省永康市金穗机械制造厂;TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器责任有限公司;HH-6型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;DHG-9070A恒温干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;新阳LG0.2型真空冷冻干燥机 新阳速动设备制造有限公司;CG21G冷冻离心机 日立有限公司;PB-10型pH计 北京赛多利斯科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料处理及游离酚提取 参照文献[22]方法进行。甘薯洗净去皮后迅速切成1 m3左右小块,经冷冻干燥后以植物粉碎机粉碎过40目筛。取10 g甘薯冻干粉,以250 mL体积分数为 60%的乙醇溶液于50 ℃水浴锅中水浴2 h提取游离酚,然后以4 ℃,8000 r/min离心25 min,离心后弃去上清液,收集残渣,按上述步骤重复提取2～3次至上清液检测不出游离酚为止,将残渣于50 ℃真空干燥至恒重后密封置于4 ℃冰箱中冷藏保存。

1.2.2 结合酚提取 参照文献[12]方法进行。取已充分提取游离酚后的干燥薯渣1 g,置于锥形瓶中,加入H2SO4溶液,置于水浴锅中水解,水解结束后以8000 r/min离心25 min,保留上清液弃去残渣,将上清液用NaOH溶液中和至pH为7,加入等体积乙酸乙酯进行萃取,重复萃取2次,合并萃取液,以旋转蒸发仪在45 ℃下浓缩蒸干,加入50%甲醇溶液超声溶解并定容至10 mL容量瓶中。

1.2.3 结合酚提取的单因素实验 以结合酚提取量为考察指标,分别以H2SO4体积分数、水解时间、液料比、水解温度为考察对象进行单因素实验,考察每个因素对甘薯结合酚提取量的影响。

1.2.3.1 H2SO4体积分数的筛选 液料比40∶1 (mL/g)、水解时间15 h、温度为50 ℃的条件下,考察体积分数分别为5%、10%、15%的H2SO4水溶液对甘薯结合酚提取量的影响。

1.2.3.2 水解时间的筛选 以体积分数为10%的H2SO4溶液为水解液,在液料比40∶1 (mL/g)、温度为50 ℃的条件下,考察水解时间分别为5、10、15、20、25 h时对甘薯结合酚提取量的影响。

1.2.3.3 液料比的筛选 以体积分数10%的H2SO4溶液为水解液,在水解时间为25 h、水解温度为50 ℃的条件下,考察液料比分别为20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1 mL/g时对甘薯结合酚提取量的影响。

1.2.3.4 水解温度的筛选 以体积分数10%的H2SO4溶液为水解液,在液料比40∶1 (mL/g)、水解时间为25 h的条件下,考察水解温度分别为30、40、50、60、70 ℃时对甘薯结合酚提取量的影响。

1.2.4 结合酚提取的响应面试验 以体积分数10%的H2SO4溶液为水解液,以结合酚提取量为考察指标,以水解时间、水解温度、液料比为编码因素,使用Design-Expert 8.05,设计3因素3水平的响应面试验。试验因素水平及编码如表1所示。

表1 试验因素水平及编码Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.2.5 多酚含量测定

1.2.5.1 标准曲线的制作 参考Mary[23]方法,精确称取没食子酸0.1 g，用蒸馏水配制成1 mg/mL溶液,分别吸取该溶液0.0、0.3、0.5、1.0、1.2、1.5 mL于10 mL刻度试管中,蒸馏水定容摇匀。然后从各浓度溶液中吸取0.5 mL加入到10 mL离心管中,分别用蒸馏水定容到5 mL,再加入0.5 mL福林酚试剂,摇匀,加入0.5 mol/L碳酸钠溶液1 mL,摇匀。放置1 h,以空白来调零,于725 nm下测定吸光度,平行测定三次。

标准曲线回归方程:y=4.927x-0.0212,R2=0.99921,式中:y代表待测样品在725 nm处的吸光度,x代表待测样中多酚的质量浓度(mg/mL)。

1.2.5.2 样品中游离酚与结合酚含量的测定 取对应样液0.5 mL,参照上述标准曲线制作方法进行测定,通过标准曲线计算其多酚类化合物的质量浓度,进而计算提取量。提取量计算公式如下:

1.2.6 12个品种甘薯游离酚与结合酚的含量测定 按1.2.1进行12个品种甘薯原料的处理和游离酚的提取,按1.2.2和1.2.4实验确定的最优工艺参数进行结合酚的提取,按1.2.5进行提取液中游离酚和结合酚含量的测定。

1.3 数据统计分析

通过Excel 2007对测定值进行统计和计算,应用SPSS 19.0软件对测定数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 甘薯结合酚提取单因素试验分析

2.1.1 H2SO4体积分数对结合酚提取量的影响 酸水解主要是通过破坏糖苷键来释放结合酚,高浓度的酸腐蚀性强,通常采用体积分数在10%左右的硫酸进行水解[11-12,24],因此,本文选取了5%、10%、15%三个体积分数的硫酸水溶液进行甘薯结合酚的酸水解释放。由图1可知,H2SO4溶液体积分数由5%升至10%时,结合酚提取率增加差异显著(p<0.05),且10%时达到最大,继续提高H2SO4溶液浓度,结合酚提取量反而降低,说明H2SO4体积分数的增加促进了糖苷键的断裂利于结合酚的释放,但体积分数继续增大会使释放出来的结合酚被破坏分解,导致结合酚提取量降低,因此,H2SO4溶液体积分数选择10%,进行后续优化试验。

图1 H2SO4体积分数对结合酚提取量的影响Fig.1 Effect of H2SO4 volume fraction on the extraction yield of bound phenol

2.1.2 水解时间对结合酚提取量的影响 以节约能源为原则,将本次试验考察时间控制在25 h以内,由图2可知,随着水解时间的增加,结合酚提取量逐渐增大,25 h达最大,说明提取时间的增加使得更多的结合酚被酸水解释放出来,但20 h后结合酚提取量增加已无显著差异,说明提取液中结合酚的浓度已趋于饱和。

图2 水解时间对结合酚提取量的影响Fig.2 Effect of hydrolysis time on the extraction yield of bound phenol注:不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。

2.1.3 液料比对结合酚提取量的影响 由图3可知,结合酚的提取量随着液料比的增大而增加(20∶1～40∶1 mL/g),可能因为溶剂用量的增大有助于结合酚的水解与多酚的浸出,当液料比为40∶1 (mL/g)时,结合酚提取量达到最大值,继续提高液料比,提取量开始降低,可能由于液料比的不断增加的同时增大了与空气的接触从而使多酚氧化,故提取量呈下降趋势。因此选择40∶1 (mL/g)为最佳液料比。

图3 液料比对结合酚提取量的影响Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratioon the extraction yield of bound phenol

2.1.4 水解温度对结合酚提取量的影响 由图4可知,随着水解温度的增加,结合酚提取率逐渐提高,增加到60 ℃时,提取量获得最大。卢婉容等[25]研究不同温度对木瓜皮结合酚水解率的影响,结果表明适当地升高温度可增加结合酚的含量,提高温度可以加速糖苷键等化学键的断裂,从而使结合酚更易被水解,提高其含量。继续增加水解温度至70 ℃后,结合酚提取率降低,可能是酚类物质由于温度过高发生分解。因此在实际操作中选择60 ℃较为适宜。

图4 水解温度对结合酚提取量的影响Fig.4 Effect of temperature on the extraction yield of bound phenol

2.2 紫薯结合酚提取响应面试验及结果分析

2.2.1 响应模型的建立与分析 本实验利用Box-Behnken中心组合试验设计响应面方案,优化并找出多因素系统中最佳提取条件。利用Design-Expert8.05软件对表2中各个条件下实验数据进行二次多项式回归拟合,通过回归模型参数估计值得到关于结合酚提取量的回归方程如下:

表2 响应面分析设计及实验结果Table 2 Program and experimental results of RSA

Y=0.21+0.023×A+0.018×B-0.025×C+0.04775×A×B-0.00048×A×C+0.023×B×C-0.016×A2-0.033×B2-0.038×C2

由表3结果可知,变量模型p<0.01,达到极显著水平,回归方程失拟检验p>0.05,失拟值差异不显著,R2=0.9587,表明 95.87% 的数据可以用此方程解释[26]。通过响应面的设计,所得模型充分拟合实验数据,即此试验方法是可靠的。方差分析结果表明,方程的一次项水解时间(A)和水解温度(B)和液料比(C)对响应值结合酚提取率影响极显著;BC(水解温度、液料比)对响应值的影响极显著,二次项A2对响应值的影响显著,B2、C2对响应值的影响极显著,由此可知,响应值是受多种因素相互影响的结果,而不是简单的线性关系。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

2.2.2 响应曲面分析 由图5a和图5b可看出,无论水解温度和液料比如何变化,结合酚提取量均随时间的增加呈现先增加而后平缓的趋势,说明水解时间与水解温度、水解时间与液料比之间无交互作用影响。由图5c可看出,水解温度对结合酚提取量的影响受液料比交互作用的影响,当液料比较小时,结合酚提取量随水解温度升高呈现先增加后下降的趋势,而当液料比较大时,结合酚提取量则呈现先增加而后平缓的趋势。

图5 各因素交互作用对结合酚提取量影响的响应曲面和等高线图Fig.5 Responsive surfaces and contour plots for each factor interaction effect on the amount of bound phenol extraction

2.2.3 验证试验 以响应面优化得到的最佳工艺参数结合,得到水解时间为21.33 h,水解温度为62.67 ℃,液料比为34.67∶1 (mL/g)时,预测提取率最大值可达0.220 g/100 g。根据实际操作条件调整参数,即水解时间22 h,水解温度62 ℃,液料比35∶1 (mL/g)进行结合酚酸水解提取,实际测得结合酚提取量为(0.212±0.004) g/100 g,达到预测值的96.36%,说明了回归模型的可靠性。

2.3 12个不同品种甘薯游离酚和结合酚的含量测定分析

由表4差异显著性分析结果可知,不同品种甘薯游离酚和结合酚含量变化范围较宽,分别为(0.14～1.63) g/100 g和(0.05～0.28) g/100 g。差异显著性分析表明各品种游离酚和结合酚含量之间存在着显著性差异(p<0.05)。经计算,甘薯游离酚含量大于结合酚,平均含量分别为0.61和0.15 (g/100 g)。在12个测试品种中,3号“紫罗兰”和4号“辽薯20”游离酚和结合酚含量均较高。张文婷等[27]测得徐薯34、徐紫8号和商薯19等12个供试甘薯品种薯块晒干样的游离酚含量变化范围在(1.74～6.16) mg/g,说明不同品种甘薯间游离酚含量变化范围较宽,从不同肉色甘薯游离酚含量平均值大小情况看以紫肉甘薯最高,与本文研究结论基本一致。而关于不同甘薯品种间结合酚含量差异的文献尚缺乏报道,从本文研究表明,其含量差异结果同游离酚类似,存在变化范围宽、紫肉甘薯中含量高的现象。据研究报道[28],紫薯的营养成分含量较普通甘薯要高,本文的研究结果为以紫肉甘薯进一步作为游离酚和结合酚提取的良好原料提供了理论依据。

表4 12个不同品种甘薯游离酚和结合酚的含量测定结果Table 4 Content determination results of free and bound phenol in 12 varieties of sweet potatos

3 结论

本研究表明,甘薯结合酚酸水解法提取的最优工艺参数为:水解时间22 h,水解温度62 ℃,液料比35∶1 (mL/g),实际提取量为(0.212±0.004) g/100 g,达到预测值的96.36%,说明本优化工艺具有可行性,可用于指导工业化生产。

通过对12种不同品种甘薯游离酚和结合酚含量的测定,表明不同甘薯品种之间游离酚和结合酚含量分别在(0.14～1.63) g/100 g和(0.05～0.28) g/100 g之间,含量差异显著且分布范围较广,其中,紫肉品种甘薯相比杏黄和浅黄肉色品种甘薯来说,具有更高的游离酚和结合酚含量,为选取富含游离酚和结合酚的甘薯品种进一步进行生物活性的研究及资源深度开发利用提供了科学依据。