馒头主要品质性状SNP标记全基因组关联分析

吴 澎，刘 娟，陈广凤，李向阳，赵子彤，杨 艺，唐晓珍，田纪春

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室，山东 泰安 271018；2.德州学院生态与园林建筑学院，山东 德州 253023；3.山东农业大学小麦品质育种研究室，作物生物学国家重点实验室，山东 泰安 271018）

馒头是深受我国人民尤其是北方人民喜爱的传统主食，年消费量约占全国面制品的46%，在我国的饮食文化以及人们日常生活中占有重要的地位[1-2]。随着当前人们生活水平的逐渐提高，对面制品的要求已不仅是满足饱腹，还要求具有良好的感官特性。因此，改良馒头用面粉品质对提高馒头整体价值具有重要意义。但目前对于馒头品质的研究多倾向于复配粉、添加剂等加工条件方面[3-12]，未能从影响馒头品质的内部因素即原料小麦基因位点的多态性角度进行研究。

全基因组关联分析是指利用一定数量的标记对所选材料的目标性状进行性状/标记间的关联定位的分析方法。最初应用于人类致病基因的研究[13-14]，Thornsberry等[15]首次将关联分析技术引入进植物领域，之后便迅速应用于多种植物的研究[16-21]。目前，对于小麦的研究已比较成熟，Yao Ji等[22]以103份冬小麦为材料对小麦4A和2A染色体上的简单重复序列标记与农艺性状进行关联分析，检测到与目标性状显著关联的简单重复序列标记；Freddy等[23]利用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism markers，SNP）标记对来自于智利、乌拉圭和国际玉米和小麦改良中心的382 个小麦品种进行全基因组关联分析，得到与小麦千粒质量、株高、产量相关的稳定基因，并发现位于染色体1A、3A和5A上的QTL可增加小麦水分利用率，从而减少水资源的浪费；Gao Liangliang等[24]利用SNP标记对小麦抗茎锈病基因进行研究，发现了21 个SNP位点，其中10 个与抗茎锈病基因Sr42有密切关联，抗病基因的获得为筛选抗病植株做出较大贡献。全基因组关联分析技术在小麦作物上的成功应用为鉴定馒头品质相关位点提供了新的思路和技术支持。本研究以205 份不同小麦品种为实验材料，通过全基因组关联分析，旨在得到与馒头品质性状紧密关联的SNP标记，为下一步结合分子育种技术改良馒头用面粉品质提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为205 种来自不同国家与地区的小麦品种，其中203 份来自中国10 个种植冬小麦的省份，剩余2 份分别来自于法国与墨西哥（表1）。供试材料中骨干亲本为132 份，高代品系73 份，高代品系均来源于山东省。

表1 供试小麦材料Table1 Information about wheat varieties used in this study

1.2 仪器与设备

TA-XT2i型质构仪 美国Stable Micro System公司；BL-220H型分析天平 岛津国际贸易（上海）有限；SF17和面机 意大利Alaska公司；CR-300型色彩色差计日本美能达公司；VF-30醒发箱 广州富康食品机械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验材料表型鉴定

在2014—2015年和2015—2016年间，分别将205 份不同小麦品种种植于山东省德州市农业科学院与山东省泰安市山东农业大学试验田。种植条件为：每份材料播种3 行，行长2 m，行间距0.25 m，每行播种70 粒，重复2 次。小麦生长期间，进行常规田间管理，没有出现严重的病虫害现象。

小麦成熟后，进行收割，并研磨成面粉，将面粉按照最初来源进行编号后参照周素梅等[25]的实验室馒头制作方法并略作改进。待馒头冷却后测量馒头的质量，馒头的体积采用菜籽置换法测量，体积与质量之比即为比容[26]。取每个馒头外表皮的表面顶端为外表面色泽测量点，选取的外表面测量点要求平整光滑，以确保所测结果的准确性，用色差仪测量其L*、a*、b*值，重复3 次。测量结束后，用切割机将馒头平行切割成3 片，取中间片的内瓤中间位置作为内表面测量点，测量其L*、a*、b*值，重复3 次。测量结束后，取馒头中间片置于质构仪上，在TPA模式下采用P35探头进行压缩实验[27]，测试前速率3.00 mm/s，测试和测试后速率1.0 mm/s，压缩距离50%。第1次压缩结束后，探头回到起始位置，等待3 s后进行第2次压缩。

1.3.2 DNA提取和90K SNP芯片分型

根据稍作改动的Triticarte方法从不同品种小麦幼叶组织中提取DNA，用0.8%琼脂糖凝胶电泳对DNA浓度和质量进行测定。委托加利弗尼亚大学生物技术检测中心，使用最新开发的包含81 587 个SNP位点的小麦90K基因芯片对DNA数据进行分型，并用GenomeStudio软件读取分型结果并保存。为确保分型数据结果的质量，用PLINK v1.07[28]进行检测，选取低基因频率大于5%和检出率大于80%的SNP标记用于馒头品质性状关联分析[29]，最终得到24 355 个SNP位点。

利用Wang Shichen等[30]整合的遗传位点信息，对本研究获得的基因位点进行整合，得到实验群体SNP复合遗传图谱信息（表2）。

表2 SNP复合遗传图谱信息Table2 Information about SNP in the integrated linkage map

1.3.3 性状与标记间的关联分析

运用TASSEL 3.0软件中的MLM_Q+K模型对馒头比容、色泽和质构性状与标记之间进行关联分析，当结果中关联标记P值小于0.001时，认为该标记与目标性状存在显著关联；P值小于0.000 1时，认为标记与目标性状存在极显著关联，当标记在2 个及以上环境中同时被检测到则认为其是目标性状相对稳定的关联位点。

1.4 数据处理

利用SPSS 18.0软件与TASSEL 3.0软件统计分析所得数据。

2 结果与分析

2.1 比容、色泽与质构性状表型变异分析

4 个环境下馒头比容、色泽与质构的表型数据如表3～5所示。各性状均有较大的变异系数，表3中，E4环境下馒头比容性状的变异系数最大（19.54%），E1环境下变异系数最小（8.45%）；表4中，色泽相关性状在E1环境下内表面a*值变异系数最大（71.73%），E4环境下外表面L*值变异系数最小（3.70%）；表5中，E1环境黏着性变异系数最大（58.50%），弹性变异系数最小（3.21%）。除个别环境外，各性状的偏度和峰度的绝对值大部分都小于1，符合正态分布，表现为数量性状遗传，适合进行关联分析。

表3 4 个环境下馒头比容在群体中的表型数据Table3 Phenotypic data of specific volume traits of steamed bread in four different environments

表4 4 个环境下馒头色泽相关性状在群体中的表型数据Table4 Phenotypic data of color traits of steamed bread in four different environments

表5 4 个环境下馒头质构在群体中的表型数据Table5 Phenotypic data of texture traits of steamed bread in four different environments

2.2 SNP标记与性状的关联分析

表6 4 个环境中与馒头比容性状相关的极显著、高贡献率和稳定位点Table6 Highly significant marker-trait associations (MTAs), MTAs with high genetic contribution and stable MTAs for specific volume traits of steamed bread in four environments

通过对性状与标记的关联分析，在显著水平（P＜0.001）上，共得到42 个比容性状显著关联位点，分布于小麦21 条染色体中的16 条，单个位点遗传变异贡献率（R2）为6.57%～18.31%。其中8 个极显著关联位点（P＜0.000 1），同时也是高遗传变异贡献率位点，2 个相对稳定位点（至少在两个环境中同时被检测到），分布于小麦的2A、2B、2D、3A、4B、6B、7A染色体上。位于7A染色体上的极显著关联位点wsnp_Ex_c14654_22713386遗传变异贡献率最大，可解释18.31%的表型变异，但只在E4环境中检测到（表6）。

表7 4 个环境中与馒头色泽相关性状极显著（P＜0.000 1）、高贡献率和稳定位点Table7 Highly significant MTAs, MTAs with high genetic contribution and stable MTAs for color traits of steamed bread in four environments

4 个环境中共检测到276 个馒头色泽性状关联位点，其中23 个极显著关联位点，9 个相对稳定关联位点，30 个高遗传变异贡献率位点，分布于小麦21 条染色体中的13 条（1A、1B、1D、2A、2B、3A、3B、4A、5B、6A、6D、7A和7D），单个位点遗传变异贡献率为7.00%～14.07%。位于7A染色体上的极显著位点Kukri_c18677_823表现出最大的遗传变异贡献率，可解释14.07%的表型变异，但只在E4环境中检测到（表7）。

表8 4 个环境中与馒头质构相关性状极显著、高贡献率和稳定位点Table8 Highly significant MTAs, MTAs with high genetic contribution and stable MTAs for texture traits of steamed bread in four environments

通过对馒头质构性状进行关联分析，共检测到313 个质构性状显著关联位点，分布于小麦的17 条染色体上，单个位点遗传变异贡献率为5.49%～25.14%。其中31 个极显著关联位点，11 个相对稳定关联位点，46 个高遗传变异贡献率位点，分布于小麦的15条染色体上（1A、1B、2A、2B、2D、3A、3B、4A、5A、5B、5D、6A、7A、7B 和7D）。同时，检测到5 个极显著位点，如2D染色体上黏聚性关联位点Kukri_c13329_800、7B染色体上咀嚼性关联位点Tdurum_contig61884_836等，在两个环境中表达，且贡献率大于10%，为主效关联位点（表8）。

3 结 论

利用24 355 个分布于小麦全基因组的SNP位点对205 种小麦粉馒头的主要品质性状（比容、色泽、质构）进行关联分析。检测到42 个馒头比容性状显著关联位点，其中8 个极显著（P＜0.000 1）且高遗传贡献位点，2 个相对稳定关联位点，分布于小麦的7 条染色体上；276 个馒头色泽性状显著关联位点，其中23 个极显著关联位点，9 个相对稳定关联位点，30 个高遗传变异贡献率位点，分布于小麦的13 条染色体上。313 个馒头质构性状显著关联位点，其中31 个极显著关联位点，11 个相对稳定关联位点，46 个高遗传变异贡献率位点，分布于小麦的15 条染色体上。同时，检测到5 个质构性状主效关联位点。这些位点的获得可用于结合小麦分子辅助育种技术，为改良馒头用小麦粉鉴定基础。