啤酒中微生物的卫生检查与结果分析

◎ 陈光申

（武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023）

啤酒是世界上消费量最大的酒类饮料，全球啤酒产量连续多年保持增长；啤酒作为一种含二氧化碳的、起泡的、低酒精度发酵酒，在全球倍受欢迎。目前，我国是世界上最大的饮料酒生产和消费国，酒类品种繁多，酿造历史悠久，是世界上产业规模最大的国家之一[1]。中国是全球啤酒市场中人均消费量增长最快的国家。2002年，中国啤酒总产量达2 386.83万t，位居世界第一，并连续16年蝉联。2013年，中国啤酒企业年总产量为5 061.54万t，同比增长4.59%[2]。随着啤酒行业的发展,消费者对啤酒质量的要求提高，在制作与销售过程中的啤酒质量控制极为关键，作为食品监测中的一项，对啤酒微生物进行检查与分析具有重要意义。

1 材料与方法[3-5]

1.1 材料

成品熟啤（市场在售啤酒随机取样）、无菌培养皿（Φ90 mm）、无菌吸管（1 mL、10 mL）、无菌生理盐水、无菌试管、酒精灯、开瓶器、无菌纱布、无菌三角瓶、平板计数琼脂培养基以及煌绿乳糖胆盐（BGLB）,双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST），1 mol·L-1NaOH，1 mol·L-1HCl，单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST），pH试纸，接种环，超净工作台及电炉（微波炉）等。

1.2 样品的采取与预处理

瓶装啤酒采用原包装样品，取原包装两瓶；用灭菌容器采取500 mL散装样品，放入灭菌磨口瓶中。

在对啤酒取样时，将瓶盖部分浸入75%的乙醇1 min后用火灼烧，用石炭酸纱布盖好，再用灭菌开瓶器启开，由于啤酒含二氧化碳，可倒500 mL灭菌磨口瓶中，口勿盖紧；覆盖灭菌布，轻轻摇荡5 min，待气体全部逸出后，进行检验。散装酒类，可直接吸取检验。

使用无菌1 mol·L-1NaOH调节样品酒pH至6.5～7.5。

1.3 菌落总数的测定

啤酒中菌落总数测定常用有2种测定方法：平板菌落计数法和菌落总数PetrifilmTM。

①测试片法。平板菌落计数是将啤酒经过一系列处理后进行计数。②菌落总数PetrifilmTM法则是将啤酒样液滴入含有培养基和指示剂的纸片上进行培养，纸片大多是灭菌滤纸、纤维膜、胶膜等，不同的培养基配置原料、方法、消毒灭菌过程等会影响PetrifilmTM的效果。

1.3.1 样品的稀释

①采用无菌操作吸取25 mL预处理后的啤酒样品，放置于装有225 mL无菌生理盐水的灭菌锥形瓶内，振荡，混合成1∶10的均匀样品稀释液。②无菌操作吸取1 mL 1∶10稀释液，注入含有9 mL无菌生理盐水的无菌试管内，振荡，混合成1∶100的均匀样品稀释液。③同上，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1 mL无菌吸管。

1.3.2 样品的处理

取稀释后的样品均液和空白稀释液（不含啤酒样品的无菌生理盐水）各1 mL，注入无菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。配制好的平板计数琼脂培养基（PCA）冷却到46 ℃后，注入平皿中约15 mL，并转动平皿，混合均匀。空白稀释液的无菌平皿做空白对照。

为使菌落均匀的分布在平板上，均匀样品稀释液加入平皿后，应尽快倾注培养基并且旋转混合均匀，可以正反两个方向旋转，从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20 min，以防止细菌死亡或繁殖。

1.3.3 培养

待琼脂凝固后，翻转平板，将其放置在（36±1）℃条件下培养（48±2）h。

1.3.4 菌落计数

培养规定时间后，立即计数。可以用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器检查，以防止遗漏。记录各平板的菌落总数，求出菌落总数。

1.3.5 菌落总数的计算方法

（1）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内（30～300 CFU），计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（毫升）样品中菌落总数结果。

（2）若有两个连续稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：

式（1）中：N—样品中菌落数；∑C—平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1—第一个适宜稀释度的平板数；n2—第二个适宜稀释度的平板数；d—稀释因子（第一稀释度）。

1.3.6 结果报告

若空白平皿中没有菌落，并且两个平行平皿中菌落数相近，则菌落总数为两平皿中的菌落平均数；若空白平皿中有菌落或两平行平皿中的菌落总数相差太大，则该实验需要重做。

1.4 大肠菌群的测定

1.4.1 样品的稀释

同1.3.1，但从制备样品均液至样品接种完毕全程应15 min内。

1.4.2 初发酵与复发酵试验

第一步是初发酵，培养基是月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）。每个样品需接种9个装有小倒管的培养基试管。其中3个试管是双料管，其余6个是单料管。取10 mL预处理样品接种在3个双料管和单料管中。经过（36±1）℃培养（24±2）h后，观察发酵管中的小倒管中是否有气泡产生，如未产气则继续培养至（48±2）h，记录24 h和48 h内产气的LST肉汤管数。都未产气者，可直接判定该样品的大肠菌群为阴性。产气者需进行复发酵。其操作是：用接种环从所有（48±2）h内发酵产气的LST肉汤管中取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤培养基（BGLB）复发酵管中，再经（36±1）℃培养（48±2）h后，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

1.4.3 大肠杆菌计数

初发酵未产气者，可直接判定为大肠杆菌阴性，复发酵产气者，计为大肠杆菌阳性，根据大肠菌群阳性管数和接种量，查大肠菌群检索MPN表，报告每克（或毫升）该样品中大肠菌群的MPN值。

2 结果与分析

啤酒的微生物部分卫生要求[6]如表1。

表1 啤酒的微生物要求表

其中，菌落总数指的是啤酒经过处理，1 mL啤酒在平板计数琼脂培养基上在（36±1）℃条件下培养（48±2）h后，生长出来的微生物菌落总数。

菌落总数作为判定食品被污染程度的标志，也可以用这一方法观察细菌在啤酒中繁殖的动态，以便对啤酒样品进行卫生学评价时提供依据。

本检测中的大肠杆菌指在（36±1）℃培养（48±2）h能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠菌群的数量以每100 mL啤酒中最可能数来表示。

由于大肠菌群直接或间接来源于人以及温血动物的粪便。大肠菌群在啤酒的卫生检查中有2方面的意义。①受粪便污染的指标菌。用来衡量啤酒生产过程中的操作卫生状况。②可作为肠道致病菌污染啤酒的指示菌。大肠菌群数量越大，啤酒中肠道致病菌存在的可能性越大。

对啤酒样品菌落总数重复测定10次，并对每个样品做两个平行测定，菌落总数、大肠杆菌测定结果如表2、表3。

表2 样品中菌落测定结果表

表3 大肠杆菌测定结果表

对比国家标准可以看出，该批次啤酒样品微生物卫生检查结果为合格。

3 讨论

啤酒作为人们社会生活中主要的酒类消费品之一，其质量与安全不仅影响着生产企业的利益，更关乎消费者的身体健康。就要求啤酒生产企业严格按照国家标准对啤酒进行微生物卫生检查；在生产过程中，要有明确的卫生控制与详细的微生物检验标准。总之，只有彻底消除啤酒中有害微生物或将有害微生物数量控制在一定范围内，才能生产出高质量的、符合消费者需求的、产品稳定性强的啤酒。因此，对啤酒中微生物的检测与分析，具有十分重要的意义。