高效液相色谱法测定水产品中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的方法优化

◎ 王嘉权，刘成文

（龙岗区水产品质量监督检测中心，广东 深圳 518000）

诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星同属于喹诺酮类抗生素，是一类人畜通用的药物。其因具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性和毒副作用小等特点，被广泛应用于畜牧、水产等养殖业中，包括在鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、鱼、虾和蟹等的养殖中用于疾病防治。喹诺酮类抗生素具有抗菌谱广、杀菌力强、作用迅速、体内分布广泛及与其他抗生素之间无交叉耐药性等特点，预防和治疗畜禽的细菌性感染及支原体病有良好的效果[1-2]。该类药物的不良反应主要有：①胃肠道反应。恶心、呕吐、不适、疼痛等。②中枢反应。头痛、头晕、睡眠不良等，并可致精神症状。③该类药物可抑制γ-氨基丁酸（GABA）的作用，因此可诱发癫痫，有癫痫病史者慎用。④影响软骨发育，孕妇、未成年儿童应慎用。⑤可产生结晶尿，尤其在碱性尿中更易发生。⑥大剂量或长期应用本类药物易致肝损害。

目前，诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星常用的液相色谱检测方法有农业部783号公告-2-2006，但该方法的前处理过程繁琐，加标回收率低。本文对该方法的前处理过程进行优化，特点是用自制的无水硫酸钠柱进行净化处理。最终结果回收率和精密度都能达到检测标准的要求。

1 材料与方法

1.1 材料准备

1.1.1 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪配2475荧光检测器，色谱柱SunFireTMC18，分析天平，旋涡振荡器，高速冷冻离心机，旋转蒸发仪。

1.1.2 试剂

乙腈（色谱纯），正乙烷(分析纯)，四丁基溴化铵(分析纯)，盐酸(分析纯)，无水硫酸钠（分析纯，经640℃灼烧4 h后存于密闭容器中备用），诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星标准品（纯度高于99%）。

1.1.3 试剂配制

①酸化乙腈：乙腈∶50%盐酸水溶液（10 000∶8）。②四丁基溴化铵溶液：精确称取3.22 g四丁基溴化铵，用水溶解磷酸调pH到3.1并定容至1 000 mL，过0.45 μm滤膜。③流动相：四丁基溴化铵溶液∶乙腈=95∶5。

1.1.4 标准曲线配制

用流动相分别配制浓度为5、10、20、50、100μg·L-1和 200 μg·L-1。

1.1.5 自制无水硫酸钠柱

准备20 mL注射器、分析滤纸和已经灼烧后的无水硫酸钠，将滤纸剪成注射器口径大小（如图1），再将剪好的滤纸放到注射器的最底部，最后将无水硫酸钠放进注射器内（如图2），自制无水硫酸钠柱完成。

图1 制作前准备的材料图

图2 完成后的无水硫酸钠柱图

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

称取5 g样品于50 mL离心管中，加5～6粒玻璃珠，加入20 mL酸化乙腈后立即振荡（防止样品结块），再加入10 mL正己烷振荡，以4 000 r·min-1离心5 min，去上层取下清层过自制无水硫酸钠柱。再加入20 mL酸化乙腈和10 mL正己烷再提取一次，去上层取下清层过自制无水硫酸钠柱，再加10 mL酸化乙腈冲洗自制柱。收集液于50 ℃旋转蒸发至近干。用2 mL流动相充分溶解定容后，10 000 r·min-1高速冷冻离心5 min，下清液过0.45 μm滤膜上机。

1.2.2 色谱条件

流动相：乙腈∶四丁基溴化铵溶液=5∶95；流速：1.5 mL·min-1；检测波长：激发波长280 nm、发射波长450 nm；柱温：40 ℃；进样量：20 μL。

2 结果与分析

2.1 校正曲线及色谱图

诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星校正曲线如图3～5所示，标准品色谱图如图6所示。

图3 诺氟沙星校正曲线图

图4 环丙沙星校正曲线图

图5 恩诺沙星校正曲线图

图6 诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星标准品色谱图

2.2 回收率和精密度

分别在空白的草鱼样品中加入0.250、0.500 mL质量浓度为100 μg·L-1的诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的混合标准溶液（5.00、10.00μg·kg-1浓度水平），0.100 mL质量浓度为1 000 μg·L-1的诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的混合标准溶液（20.0 μg·kg-1浓度水平)，按本文方法进行测定，平行测定6次，方法的回收率在 73.0%～87.3%，相对标准偏差为4.93%～7.59%，结果见表1。

表1 样品中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的加标回收率以及精密度表

从结果表1可以看出，使用本文优化后的方法进行检测，诺氟沙星的回收率为78.2%～87.3%，相对标准偏差为4.93%～6.95%；环丙沙星的回收率为75.0%～82.1%，相对标准偏差为5.93%～7.54%；恩诺沙星的回收率为73.0%～84.2%，相对标准偏差5.93%～7.59%。符合标准要求。

3 结论

本方法的特点是使用了自制的无水硫酸钠柱对样品进行吸水和净化，与农业部738号公告-2-2006标准方法相比起来步骤更为简便，减少在实验中提取液转移的次数，从而既能降低时间成本又能保证较高的回收率，提高检测效率。本次试验结果证明，优化后的检测方法能满足日常检测工作需求，可用于水产品中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星药物残留量的测定。