食品中单核细胞增生李斯特氏菌检出能力验证结果与分析

◎ 殷 欢，梁梅娟，苏佩冰，陈靖欣

（中山市食品药品检验所，广东 中山 528437）

单核细胞增生李斯特菌（以下简称单增李斯特菌）在自然界中广泛分布，是一种食源性疾病的致病菌并能够引起人畜共患病。在食品中存在的单增李斯特菌对人类的健康产生威胁，引起新生儿脑膜炎及成人败血病等疾病。单增李斯特菌能够在冷藏温度下生长，在肉类、蔬菜水果、乳制品以及海产品等冷藏食品中检出率较高，已成为食物保鲜中过程中存在的安全隐患[1]。美国疾病预防控制中心（CDC）网站上陆续报道了从2011年7月31日出现首例单增李斯特菌病例报告至同年12月8日，感染人数多达147例，死亡33例[2]。2018年7月9日英国《每日邮报》报道，近期，欧洲李斯特氏菌感染爆发，一批被李斯特氏病菌污染的冰冻甜玉米已导致47人患病，其中9人死亡[3]。2018年11月22日，欧盟食品和饲料快速预警系统（RASFF）发布4则涉及产品疑含李斯特菌的警示通报，产品为匈牙利的熏培根、奥地利的牛肉片、波兰的熏挪威三文鱼[4]。由单增李斯特菌导致的食源性疾病的爆发以及带来的潜在风险警示我们，在食品检验过程中准确快速检出单增李斯特菌具有极其重要的意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

样品编号为M228d02A、M228d02B，样品状态为密封瓶装固体，样品数量为2份。

1.2 实验试剂

本次实验所用的培养基、即用型血琼脂平板、生化鉴定管套装购自北京陆桥技术有限责任公司；李斯特显色培养基由科玛嘉公司生产。革兰氏阳性细菌鉴定卡GP卡，AIPLAB软件，APIListeria 10300试剂盒由法国生物梅里埃公司提供。全自动微生物基因指纹鉴定系统（RiboPrinter）配套试剂由美国杜邦公司提供。

1.3 实验仪器

全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2-Compact），购自法国生物梅里埃公司；RiboPrinter全自动微生物基因指纹鉴定系统，购自美国杜邦公司；SSW-600-2S型电热恒温水槽，购自上海博讯实业有限公司；SG603A-HE型生物安全柜，购自美国BAKER公司；拍打式均质器，购自法国interscience公司；RCT Basic型磁力搅拌器和MS3基本型圆周振荡器，均购自广州艾卡仪器设备有限公司；细菌镜检设备是日本奥林巴斯生产的CX41型生物显微镜；BD260型电热恒温培养箱，购自德国宾得公司； HVA-85型高压灭菌器，购自日本Hirayama公司。

1.4 实验方法

按照《鸡肉中李斯特菌属、单增李斯特菌检验（定性）能力验证》样品作业指导书的要求对样品进行检测前处理，并依据GB 4789.30-2016 单核细胞增生李斯特氏菌检验进行增菌，分离，初筛以及鉴定。同时以APIListeria 10300试剂盒、全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2- Compact）和全自动微生物基因指纹图谱鉴定系统（RiboPrinter）进行菌种鉴定，最终综合以上试验结果报告。检验流程见图1，同时以单增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌作为阳性对照菌进行试验。以英诺克李斯特氏菌作为阴性对照菌。

图1 检验流程图

1.4.1 样品前处理

将20 mL BPW加入到每个样品瓶中，轻轻颠倒几次后静置30 min使样品瓶中鸡肉液化。

1.4.2 检样

样品瓶中液体全部转移至225 mL LB1增菌液中，均质后至于30 ℃培养箱，培养24 h。吸取0.1 mL样品匀液加入到10 mL LB2增菌液中，至于30 ℃培养箱，培养24 h。取LB2二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色平板和PALCAM琼脂平板，于36 ℃培养24～48 h，观察各个平板上生长的菌落。记录观察24～48 h菌落的生长状态。

1.4.3 初筛

自选择性琼脂平板上分别挑取3～5个典型或可疑菌落，分别接种木糖、鼠李糖发酵管， 于36 ℃培养24 h，同时在TSA-YE平板上划线，于36 ℃培养24 h，然后选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。

1.4.4 鉴定

根据GB 4789.30-2016中传统鉴定方法的要求，对可疑菌株革兰氏染色镜检、SIM培养基动力试验、生化鉴定。主要包括木糖、鼠李糖、过氧化氢酶试验、七叶苷试验、甘露醇试验、溶血试验、协同溶血试验、麦芽糖试验、葡萄糖试验、MR-VP试验。

1.4.5 API法鉴定

按照产品说明书进行操作，36 ℃孵育24 h后取出。

1.4.6 全自动微生物生化鉴定系统(VITEK2-Compact)鉴定

分别从TSA平板上挑取单个菌落，制成符合仪器浊度的菌悬液。用GP鉴定卡，按照仪器操作规程，采用VITEK2-Compact菌种鉴定系统进行鉴定。

1.4.7 全自动微生物基因指纹图谱鉴定系统（RiboPrinter）鉴定

挑取新鲜菌落1～3个，悬浮于40 μL样品缓冲液中， 混匀后吸取30μL于样品杯中， 热灭活后各加入5 μL裂解液A和裂解液B，放置于RiboPrinter 样品孔中。运行程序，选用 EcoR I酶切系统。杂交图谱选择与DuPont ID数据库进行比对，得出待测菌株信息。

2 结果与分析

国家标准法中传统鉴定方法作为标准评价API法、全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2-Compact）和全自动微生物基因指纹鉴定系统（RiboPrinter）。四种方法均能准确在编号为M228d02A 的样品中检出单增李斯特菌。API法、全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2-Compact）和全自动微生物基因指纹鉴定系统（RiboPrinter）在培养和鉴定耗时方面有明显优势。具体情况见表1。

表1 单增李斯特菌检出过程表

3 讨论

采用食品安全国家标准方法中的传统方法来检测单增李斯特菌，分离鉴定方法较简单但是操作繁琐费时费力，一般需要5～7 d完成，难以满足快速检测的需求[5]。对于菌落的观察、溶血试验及协同溶血试验等内容对操作人员的能力有一定的考验。同时传统国家标准法的生化鉴定管一般采用安瓿瓶，操作过程容易划伤操作人员的手。API法通过制作菌悬液一次接种试剂条培养即可，培养后通过观察自然反应以及加入附加试剂的变色反应来判定酶以及糖发酵产物的反应结果。操作过程耗时较少、操作简单安全。API法有效地弥补了传统检测方法中的不足之处，有效提高检测时效及准确率，特别适合从事微生物检验工作初期的检验人员[6]。全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2-Compact）和全自动微生物基因指纹鉴定系统（RiboPrinter）在操作和鉴定用时方面有明显优势，通过分离出的可疑菌株的纯培养物进行快速鉴定。本试验通过使用多种方法对可疑的典型菌落均做出了正确的判断，方法之间可以互相佐证，为快速鉴定单增李斯特菌提供多种可行性。因此，API Listeria李斯特菌鉴定试剂盒、全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2-Compact）以及全自动微生物基因指纹图谱鉴定系统（RiboPrinter）等越来越多自动化、系统化的方法被应用在单增李斯特菌的检测中。