常见乌头类生物碱涉案检材及前处理技术

钟世豪， 任昕昕， 于忠山

(1.中国人民公安大学， 北京 100038; 2.公安部物证鉴定中心， 北京 100038)

0 引言

毛茛科植物常用在中药中，可入药的成分绝大部分存在于翠雀属和乌头属植物当中[1]，将乌头、附子等植物作为药物使用在我国多个医家学派中均有悠久的历史[2]。世界范围内有超过300种的乌头属植物[3]，仅在中国境内的毛茛科植物就多达200多种[4]。毛茛科植物块茎构成的复方中药通常具有较高的抗炎[5]、止痛温经[6]、除湿祛风[7]等效果，是饱受头风喉痹和各种风湿类风湿病痛患者的良方[8]，同时对肠胃炎、腹泻、水肿[9]、肿瘤[10]以及支气管哮喘[11]等病症均有一定的疗效。毛茛科植物本身的作用可能远远大于此，有很多最新研究表明乌头类植物所含的药用成分可能对其他免疫或病因不明的疾病具有良好的抑制和缓解作用，亦可改善衰竭心脏心率[12]。乌头碱类化合物在合成工业上也具有很大的意义，诸如使用乌头碱制备昂贵的BCD环状体系[13]。

古著医术中常说是药三分毒[14]，毛茛科植物虽然药用前景广泛，但作用机理[15]及治疗窗[16]尚且不明，即使是专业医师也对毛茛科植物在医用用量上也十分谨慎[17]，主要原因是毛茛科植物所含的药用活性成分乌头碱、滇乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等乌头类生物碱，也是毒性成分[18]，乌头类生物碱毒性极大[19-21]。乌头类生物碱中毒性最强的当属乌头碱，其LD50为0.308 mg/kg[22]。生物对于乌头类生物碱的个体耐受性差异较大[23]，对于一个健康的成人的致死剂量约为1～2 mg[24]。毛茛科植物作为药物如果处理不当，会导致其中所含的剧毒成分乌头类生物碱仍有过量残留，进入生物体后会影响钾离子和钙离子的延时整流效应[25]，造成服用者心室纤维颤动[26]，对心脏、神经、肝脏细胞均有作用[27]，危及使用者的身体健康或形成更严重的后果。

乌头类生物碱中毒后一般在血液、尿液及肝脏中都可以检测出，在法庭科学领域，常见乌头类生物碱涉案检材是根据中毒后客体的状态选择合适检材进行分析，一般选择血液、尿液以及肝脏。

1 乌头类生物碱中毒的常见原因

乌头类生物碱毒性极强，毒性分级上属于剧毒，解毒机制尚不明确[28]，目前没有解毒特效药，因此在乌头类生物碱中毒的解毒和救治上面临诸多困难[29]。鉴于以上原因，乌头类生物碱也常被用自杀和他杀案件中。其中毒症状与心脏病所产生的症状十分类似[30]，因此使用乌头类生物碱投毒的案件在判断上也具有一定的迷惑性。

乌头、附子等植物常被作为复方药剂和炮制药酒等过程中用到的原材料[31]，在治疗风湿骨病、跌打肿痛方面也有很高的疗效。由于很多民众知道此类药物在各种病症方面的疗效，但没有意识到其潜在的毒害性，对此药物在使用时处理不谨慎，导致意外事故的发生。虽然泡制乌头酒在治疗疼痛炎症上有很好的疗效[32]，但药材处理不规范，用量不当极易引发中毒的意外，且酒精也会协同药材中的乌头类生物碱，使其毒性增强[33]。在中国的一些山区甚至有将草乌和川乌这类有剧毒的毛茛科植物作为食材，与禽畜肉炖煮后食用的习惯[34]。另外在我国云南等地常常有当地居民私自采摘乌头、附子等植物，经过简单的炮制处理后直接当做药物使用，但炮制过程常不遵循中药炮制国家标准[35-36]，导致药物仍有一定毒物残留危及使用者健康及生命。少数事故中也有混淆植物种类，误食含有乌头类生物碱的植物而造成悲剧[37-38]。

结合中毒原因和相关法律，在刑事科学领域对乌头类生物碱涉案检材前处理及检测方式的研究也至关重要。

2 常见案件及其检材

含乌头类生物碱的药物种类多样，乌头类生物碱在自杀他杀案件中投毒的客体也有差异，根据法规[39]被投放毒物的物质也要接受检验。犯案过程中使用的容器也是检测的对象。

对于生物体而言，乌头类生物碱涉案检材一般选择血液或肝脏。个别案例中，中毒对象仍然存活，但由于乌头类生物碱在活体体内代谢速度快，超过24 h后，生物体内的血液难以成为乌头类生物碱定性定量的的首选，但生物体的尿液在服用乌头类生物碱的连续6天的时间里都能检测出待测物[40]，此时也会根据情况选择尿液检测。生物体在摄入乌头类生物碱后，3小时内脏器浓度胆囊>肝脏>肾脏>肺和脾，3小时后主要集中在肝脏[41]。

鉴于乌头类生物碱剧毒，且在误食、他杀自杀案件中常有涉及，对于生物体而言，3种(血液、尿液以及肝脏)常见乌头类生物碱涉案检材的研究具有很大的意义。血液为生物体中常见组织液，毒素通过血液的循环到达身体各处，乌头类生物碱中毒者尿液中乌头类生物碱的含量通常大于血液中的含量，且对于尿液中的乌头类生物碱可检测周期长。肝脏是生物机体的重要代谢器官，所以肝脏是对人体有毒物质摄入和代谢的重要研究器官[42]。

在部分案例中疑似服用不当处理、或含有毒成分的药物，在这些案例中药粉、药片乃至药渣等[43-46]也会成为法庭科学的检测对象。

3 常见检材与相应前处理技术

根据对常见乌头类生物碱涉案检材分析，可以看出乌头类生物碱涉案的检材具有一定复杂性。正是由其复杂性导致对于不同案件的检材在预处理、分析手段及定性定量效果方面都不近相同。

由于乌头类生物碱的理化性质，乌头类生物碱涉案检材具有一定的特殊性，多种乌头类生物碱都在碱性、水中以及高温的条件下极易分解[47]，即双酯型二萜生物碱转化单酯型二萜生物碱及胺类生物碱[48]，这也是炮制处理乌头、附子等毛茛科植物过程中，各种乌头类生物碱之间的化学转化情况。常见具有药物活性的乌头类生物碱结构见表1。正是由于经常涉案的几种乌头类生物碱具有这种特殊性质，在刑事科学技术领域甚至其他领域对其的研究都选不易破坏检材的方法进行定性和定量。

表1 常见4种乌头碱结构

待测物质的理化性质决定了对目标物的分析方法，不同的分析方法的处理方法有所不同。因此，可用分析方法为各种前处理技术进行分类，浅谈各种常见前处理手段的利弊。

3.1 液相色谱及液质联用的常用前处理方法

液相色谱法具有可以分析难挥发、易分解的物质的能力。根据乌头类生物碱的理化性质，经过适当前处理后，常使用液相色谱分析乌头类生物碱引发的案件检材。单一使用液相色谱在物质定性方面有所欠缺，因此经常和质谱等仪器联用，不但弥补了液相色谱在定性能力上的不足，更弥补了质谱在定量能力上的欠缺，两种类型的仪器互相取长补短，更好地实现对物质的分析[49]，对于乌头类生物碱的检测也有实验选择高压液相色谱- 质谱联用法[50]。

在液相色谱或者液相色谱- 质联用作为分析仪器时前处理方式也不尽相同，根据检材、仪器条件等因素前处理方式会有变化。

对于血液和尿液检材在使用液相色谱时，方法的差异主要集中在如何将血液和尿液进行前处理，要达分析仪器进样的要求。

血液检材在前处理沉淀蛋白阶段常用甲醇、丙酮、乙酸乙酯以及各种无机盐、乙腈或乙腈和甲醇等[51-52]物质进行混合对检材进行处理，其中乙腈和甲醇为首选，甲醇提取也不会引起电离抑制[53]。流动相选择为碱性的条件下，也会选用乙酸铵和氨水的混合溶液缓冲pH为9后加入甲醇后进行超声处理的方式沉淀蛋白[54],但是选择高pH的沉淀蛋白方法可能会造成易水解的乌头类生物碱的不稳定。传统乙腈沉淀蛋白为使用率最高的方法，但是对血液中的乌头类生物碱的提取回收率普遍在72%～85%[55]。

大多数实验方法中会选择离心作为下一步操作，但在较新的研究成果中也有选用在线固相萃取技术对检材进行进一步的处理，不但可以处理血液检材，对尿液检材也有很好的效果，快捷高效[56]。另外采用中空纤维固相微萃取[57]技术对于痕量检材的预处理和保护性也有一定的提升，技术也在逐步开发和应用在此类检材的处理中。

通过上述操作后将待测液体过膜处理，但在有些文献的处理中选择在过膜后通氮气吹干，并用初始流动相定容到合适的浓度后进行进样检测，这样可以明显改善基质效应[58]。对于乌头类生物碱药物中毒案件血液检材的预处理也在不断地改善。使用液相色谱或者液相色谱- 质谱分析各种毒物涉案案件中的生物检材，处理方法都有一定相似，但在细节处理上有一定的差异。

而对于药片、药粉以及药渣等组成有一定复杂性的检材，也会使用液相色谱或液质联用进行分析。处理方法比较血液处理方式相比差异较大。

常见对于可能含有乌头类生物碱的药片、药粉、药渣等检材的处理一般先选取适检材，将其研磨成粉状后过适当筛目筛子[59]，舍弃大体积药材并取筛下药粉利用去离子水浸泡一定时间后加热回流，萃取得到检材中的有效成分。吹干后加入合适的溶剂或流动相定容，透过0.22 μm微孔滤膜，最终得到可以利用液相色谱检测的检材[60]。检材过筛后加入乙腈超声提取，离心后进样分析[61]也对处理含有乌头类生物碱的药片、药粉以及药渣的常用处理手段手段。

很多液体待测物都适用于利用固相萃取法进行前处理[62]。因此，对于乌头类生物碱涉案的药片萃取液、血液以及尿液检材也常选用固相萃取(SPE)法进行前处理[63]，处理后便可直接进样。

3.2 气相色谱及其联用

使用气相色谱- 质谱联用仪器进行检测含有乌头类生物碱的生物样本时，检材用乙腈进行沉淀蛋白，键合到硅胶盒上，蒸发干燥后用BSTFA硅烷化或采用裂解处理后进样[64]。由于气相色谱分析乌头类生物碱需要进行衍生化后进样，大大加大了前处理时间和成本，因此利用色质谱联用处理乌头类生物碱涉案检材方法渐渐被其他方式取代。

3.3 直接使用质谱进行分析

利用质谱进行分析主要是根据质谱不同电离源有不同特性，例如ESI-MS/MS对质子亲和势能较高的生物碱有较强的分析能力，并利用丢失的中性脂肪酸特征来推测其结构[65]。通过质谱图中的相对丰度信息也可以定量。

直接使用各种质量分析器的质谱法对涉案检材进行分析的前处理与使用液相色谱-质谱联用法分析的相关处理有一定的相似性，无论是血液检材还是待测药物本身，都要选用合适沉淀蛋白试剂将内部的杂质和影响检测的蛋白质除去。离心后取样进入质谱(大多数实验中基本只选用过膜作为第二步处理，并在处理后直接进样)，处理方式与使用液相色谱或液质联用进行检测相比较为简单。

而对于直接使用质谱法进行分析所采集的信息多为质谱的一级、二级质谱图，并用两级质谱的m/z进行定性。并通过其相对丰度判定是否为主要物质。

质谱法检测乌头类生物碱涉案检材方法简单快捷[66]，但仅仅适合简单推算物质的结构，或者对于大体成分已知的药物检材中的某一疑似物质的检测，在实际案件的使用中，可以对检材的检测起到一定辅助作用，由于规范性和行标的约束，单一使用质谱进行定性虽然有可行性，但一般只用于初步检测和试探性检测。

4 乌头类生物碱涉案检材前处理技术前瞻

涉及乌头类生物碱的案件繁多。日常案件中乌头类生物碱涉案检材面临着内部成分乌头类生物碱的分解[67]，因此对于含有乌头类生物碱的检材及样品保存和预处理上都有建立在其稳定性上的要求[68]。应在预处理阶段尽可能降低基质对于检材待测物检出的影响的同时，把优化建立在考虑到物质的稳定性的基础之上。研究乌头类生物碱的分解速率对于检材原始含量的推算，以及涉及乌头类生物碱案件检材的最理想保存条件的确定都有重大的意义。检材的预处理是影响检材作为证据的关键一步。2003年美国农业部研发的QuEChERS前处理法简单、方便，所以对于检材和其他待检测物品的预处理逐年以来越来越成为人们研究的重点方向之一[69]。但对于乌头类生物碱涉案案件和事故中的检材能否适用于QuEChERS方法，能否将QuEChERS方法进行适当改进或者与传统检材的处理方式相结合，是个值得深入研究的问题。凝胶电泳对于液体检材的检测改善基质效应，一定程度提升检测限[70]，但能否适用于乌头类生物碱也待考证。

因前处理手段与回收率、检测限有很大的关系。回收率更高的前处理技术，也是还原案件真相更加有利的技术。在法庭科学领域若能将高回收率的前处理技术与高灵敏度的检测方法相结合，能够大幅度提升检测限，接近检材的真实浓度，还原案件真实情况。