MicroRNA在法庭科学鉴定中的最新应用研究

刘 卓， 贾振军

(中国人民公安大学刑事科学技术学院， 北京 100038)

0 引言

MicroRNA (miRNA)是一类内源性表达、平均片段长度约为22nt的非编码小分子RNA。miRNA广泛存在于各种真核组织和体液中，它们靶向结合互补的mRNA序列，促进了mRNA的降解或者抑制了mRNA的翻译，从而在转录后水平上调节了基因表达[1,2]。

miRNA的表达调节了一系列生物学过程，包括有机体的发育、组织器官的分化、疾病的发生等[3-13]，其表达模式蕴含了丰富的生物学信息。此外，miRNA在各种类型的样本中都能较为完好的保存，血浆、尿液甚至福尔马林固定过的组织中都可以提取到miRNA，且目前检测其表达水平的技术手段具有很高的灵敏度[14]。这些特点都表明miRNA可成为良好的生物标记分子。

在法庭科学领域，大量研究已发现不同体液或者组织中的miRNA表达谱具有差异性[15-24]，可据此进行体液或组织来源的鉴定，还有研究表明可通过miRNA表达的特异性变化推测死亡方式[25]。近年来，随着miRNA检测技术的进步，在此领域又有了很多新的研究成果。

1 MicroRNA检测技术

传统的miRNA检测技术包括微阵列方法(microRNA microarray)和定量反转录PCR(qRT-PCR)。前者基于核酸杂交技术，先对样本中提取的miRNA进行荧光标记，再将这些miRNA与DNA探针进行杂交，筛选出样本中的miRNA；后者是先将样本中提取的miRNA反转录为cDNA，随后再对cDNA进行PCR并实时监控PCR产物量的累积，通过生成的PCR产物的水平来反映原样本中miRNA的表达水平。通常将两种方法结合起来，即先通过微阵列筛选出不同样本中表达水平差异性较大的若干个miRNA分子，再通过定量反转录PCR对筛选出的miRNA分子进行确认。近些年来，高通量测序方法应用到miRNA的检测中，即先通过反转录获得样品miRNA的cDNA库, 接着对cDNA库进行高通量测序，测序的过程中读取不同序列的miRNA分子的相对含量，以此获得样本中miRNA的表达谱。3种方法中，只有高通量测序方法可用于新miRNA分子的发现，并且可以很好的区分序列相似的miRNA分子。

2 MicroRNA在法庭科学鉴定中的最新研究

2.1 鉴定体液或组织来源

大量的研究表明不同体液来源的miRNA分子表达谱具有显著性差异[19, 21, 23, 24, 26-29]。表1展示了一些研究中发现的常见体液(血液、精液、唾液、阴道分泌液)中特异性表达的miRNA分子，但比较后会发现不同的研究小组所得出的结果不完全相同，即标记同一种体液的miRNA分子有区别，造成这种差异的原因可能是检测的技术方法以及使用的引物等的不同。为了使鉴定结果更准确可靠，研究者们还引入了一些算法模型来计算miRNA分子的表达水平，通过计算结果来进行体液来源鉴定[20, 26]。

通过miRNA鉴定体液来源还可与DNA分型同时进行。van der Meer等人使用毛细管电泳的方法进行miRNA分型。他们从血液和唾液中提取DNA和miRNA，接着通过反转录PCR合成cDNA，得到了包含DNA和cDNA的混合提取物。使用毛细管电泳的方法对提取物进行标准的STR分型，除了得到DNA分型图谱外，血液样本的STR分型图谱都包含一个表征血液的miRNA峰，而唾液的STR分型图则包含了表征唾液的miRNA峰[30]。

与传统的微阵列方法相比，高通量测序方法具有更准确(不易出现假阳性结果)、更全面(能够发现新的miRNA分子)的优势。基于这种方法，Wang 等人的研究找到了6种用于鉴定静脉血的miRNA分子和19种用于鉴定唾液的miRNA分子[31]，其中一部分和前人的研究结果一致，另一部分则完全不同(表1)，这可能是由于高通量测序方法找到了之前研究中使用传统检测方法没有发现的miRNA分子，但这些研究结果还有待进一步证实。

表1 miRNA在体液中的差异性表达

除了鉴定体液来源外，miRNA分型还可用于通过痕量样本确定器官或组织来源。Sauer等人的研究发现， miRNA分析能够很可靠的区分器官组织(脑、肾、肺、肝、心肌、骨骼肌、皮肤)，同时不影响DNA分型的操作。因此可以作为DNA分型的补充，分析一些实际的混合样本、降解样本以及枪击或者穿刺后产生的痕量样本[32]。

2.2 为还原案情提供线索

除了作为潜在的分子标记进行体液或组织来源鉴定外，miRNA还能为案件还原提供一些重要信息。Johnson等人使用大鼠作为动物模型，使用棉签收集大鼠头部枪伤后形成的血迹斑可检测到脑组织的分子标记miR-124-3p，这意味着可以通过miR-124-3p来鉴定遗留在现场的血痕是来源于头部枪伤还是胸部枪伤，这就为还原案情提供了重要信息[33]。在后续研究中，他们用刀片在大鼠的肝部造成贯穿伤，检测伤口流出的血液中是否有肝组织的标记分子 rno-mir-122-3p，结果发现，在使用的刀片上提取微量样本，其中有67%能够检测出rno-mir-122-3p，而在滴出的血液中也有57%能够检测到rno-mir-122-3p[34]。这些结果都表明可以通过miRNA来鉴定血痕来源的组织，为还原案件的发生过程提供信息。

2.3 通过microRNA推测死亡方式

疾病发生和外界刺激都会引起miRNA的表达发生变化，这使miRNA可能成为鉴定死亡原因的分子标记。Yu等人使用小鼠溺亡模型，发现有8种特异性的miRNA分子在淡水中溺亡的小鼠脑部表达增加，而在海水中溺亡的小鼠脑部表达下降[25]。其中，miR-706(靶向HCN1)在淡水中溺亡的小鼠脑中的表达显著高于海水中溺亡小鼠。Menathung等人检测了急性心肌梗塞死亡后的人血样，发现和对照组相比，miR-499的表达水平显著增加[35]。这些结果都表明可通过miRNA分子的表达变化来推测可能的死亡原因，为法庭科学取证提供了新的思路。

2.4 通过microRNA鉴定涉毒和吸毒史

成瘾药物例如吗啡、可卡因和安非他明等的使用会引起miRNA分子的表达谱发生变化[36-40]。这些相关的研究结果除了揭示成瘾相关的生物学机制外，还提示miRNA分子能够作为诊断药物成瘾或者鉴定涉毒的生物标记物。如在海洛因依赖的患者群体中，其外周血单核细胞中的一些miRNA分子如miR-582-5p、miR-590-5等的水平与健康人相比是下降的[37, 41]；海洛因滥用者血浆中的miRNA分子表达谱也发生了特异性的变化，有11种miRNA分子表达水平上升，有9种miRNA分子表达水平下降[36]。除了海洛因之外，甲基苯丙胺滥用病人血浆中的miRNA表达谱也得到了研究。与健康人群相比较，甲基苯丙胺滥用病人血浆中miR181a、miR15b、miR-let-7e和miR-let-7d的表达明显下降，更有趣的是，这种变化程度与过去数月中的药物使用频率呈负相关[42]。

上述研究结果都提示特定的miRNA分子及特异性的miRNA表达谱都有望成为鉴定涉毒和毒品滥用史的新型生物标记物。如果能够进一步对各类滥用毒品人群的血浆miRNA或血细胞miRNA的表达谱进行充分研究，并找到其与药物使用频率之间的关联性，那么miRNA分子将可能成为鉴定毒品滥用、推断个体身份和识别个人背景的有力证据。

3 问题和展望

miRNA作为一种生物标记分子，在鉴定体液来源、还原案情、推断死亡方式以及鉴定涉毒等方面拥有潜在的应用价值，但目前仍然存在一些明显的问题，其中最大的挑战莫过于使用的检测手段等的不同可能会造成检验结果不一致的情况。因此，要使miRNA分子作为新型生物标记物应用在法庭科学领域，还需要大量的研究工作作为理论基础，同时需要规范化的技术流程和技术平台，做到如同DNA分型一样，能够在任何实验室得到一致并且可靠的鉴定结果。虽然目前miRNA作为生物标记分子的应用还不成熟，但其作为小分子具有明显的操作优势，并且蕴含了很多DNA分子所不能提供的丰富信息，相信以后随着技术的进步和进一步研究的投入，它们在未来的法庭科学鉴定中将会发挥巨大的应用价值。