甲状腺乳头状癌细针穿刺涂片中Galectin-3、Cytokeratin-19的表达及其临床意义

龙兆博 张 苗 司婷婷 张 进 秦 娟

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是临床上比较常见的内分泌肿瘤，也是目前发病率上升最快的实体性肿瘤之一[1-2]。当前由于各种因素的影响，PTC在我国的发病人数逐年增加。随着医学技术的提高，PTC患者5年生存率已经超过了60%，但是加强早期预防与诊断依然是改善PTC预后的重要方法。PTC的病理诊断主要依赖于其复杂的乳头状结构和典型的核特征，但是部分良性甲状腺病变也可以伴有与PTC的真乳头，但是诊断效果不佳[3-4]。当前PTC的病因尚不十分清楚，其中经历了多步骤、多阶段、多因素、多基因变异参与的复杂的生物学演变过程[5-6]。近年来，随着分子遗传学的研究与不断发展的分子生物学、免疫学技术相结合，越来越深入于对PTC在分子水平致病机制的研究[7]。研究显示多个癌基因的异常激活和编码蛋白的过度表达以及抑癌基因的缺失、突变失活导致细胞增殖失控而恶性转化，可能是PTC发生的分子生物学基础[8-10]。当前已有一些特异性较强的应用于甲状腺良恶性疾病鉴别诊断的分子标记物，包括半乳糖凝集素3(Galectin-3)、细胞角蛋白19(Gytokeratin-19)等[11-13]。甲状腺乳头状癌细针穿刺涂片能提高甲状腺癌诊断的灵敏度和特异度，当前在一些地区已经推广使用[14-15]。本文具体探讨了甲状腺乳头状癌细针穿刺涂片中Galectin-3、Cytokeratin-19的表达及其临床意义，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

2016年1月到2017年1月选择我院收治的甲状腺组织样本120例，其中正常甲状腺组织90例(对照组)，PTC组织30例(观察组)。纳入标准：所有患者的临床病例资料完整；术前未接受化疗、放疗、内分泌治疗等任何治疗的患者；年龄在20～80岁之间；研究得到医院伦理委员会的批准。排除标准：双侧原发性PTC；PTC外其他所有类型恶性肿瘤；临床资料不明确且病理科无完整切片或石蜡档案；妊娠与哺乳期妇女。对照组中男性20例，女性70例；年龄最小28岁，最大57岁，平均年龄(48.33±3.11)岁；平均体重指数为(23.11±2.94)kg/m2。观察组中男性18例，女性12例；年龄最小29岁，最大58岁，平均(49.11±2.87)岁；平均体重指数为(23.98±1.82)kg/m2；病理分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期10例，Ⅲ期4例；分化程度：低分化18例，中分化6例，高分化6例；淋巴结转移：无转移20例，有转移10例。2组的性别、年龄、体重指数对比，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 细针穿刺涂片方法

取患者舒适的体位，利用超声显示甲状腺内的目标病灶，确定进针部位和路径，并用记号笔标记穿刺点。常规消毒穿刺部位，局部浸润麻醉穿刺点。使用带有6-7号针头的注射器进针入目标病灶内，扭转针尖切割缘并上下提插，不要让标本进到注射器内。拔出穿刺针，将吸取的组织均匀涂片，并用95%乙醇固定。

1.3 免疫组化检测

免疫组化染色试剂盒购自于福建迈新生物技术有限公司，DAB(3，3-二氨基联苯胺Tris缓冲液)显色试剂盒购自福建迈新生物技术有限公司。采用Envision二步法检测Galectin-3、Cytokeratin-19蛋白的表达情况，鼠抗人Galectin-3、Cytokeratin-193单克隆抗体都购自博士德生物有限公司。以已知的阳性对照染色片为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照。选择经HE染色证实的甲状腺组织石蜡块，3 μm石蜡切片，放置于载玻片，60 ℃烤片4 h；二甲苯脱蜡2次，酒精梯度脱水后进行水洗；修复抗原，蒸馏水冲洗，5 min×3次；3% H2O2溶液处理15 min，PBS冲洗，5 min×3次；一抗常温孵育1 h，PBS冲洗，5 min×3次；二抗25 ℃孵育15 min，PBS冲洗，5 min×3次；DAB室温下3～5 min显色，苏木精复染细胞核1～2 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察。每张切片由两位病理专家独立阅片共同协商出判断结果。

1.4 临床资料调查

调查了所有患者的性别、病案号、年龄、体重指数、联系电话、病理分期、分化程度、淋巴结转移等情况。同时详细记录了2组的组织标本中免疫组织化学染色Galectin-3、Cytokeratin-19的表达情况。

1.5 统计学方法

应用SPSS20.00 for windows软件包进行统计学分析Galectin-3、Cytokeratin-19蛋白在组织中的表达情况及其与临床病理参数之间的关系，采用χ2法或Fisher精确概率法进行统计学检验，计量数据对比采用t检验分析，相关性分析采用 Spearman 等级相关分析，影响因素分析采用多因素非条件logistic回归分析，以P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Galectin-3、Cytokeratin-19在甲状腺组织中的表达对比

Galectin-3、Cytokeratin-19在对照组的阳性表达率为15.6%和4.4%，在观察组中的阳性表达率为80.0%和90.0%，观察组都高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 Galectin-3、Cytokeratin-19在甲状腺组织中的阳性表达对比(例，%)

2.2 Galectin-3、Cytokeratin-19在PTC组织中表达与临床特征的相关性

Galectin-3、Cytokeratin-19在PTC组织中的阳性表达率与PTC的病理分期、分化程度、淋巴结转移明显相关(P<0.05)。Spearman 等级相关分析显示PTC的Galectin-3、Cytokeratin-19的阳性表达呈明显相关性(γ=0.607，P<0.05)。见表2。

表2 Galectin-3、Cytokeratin-19在PTC组织中表达与临床特征的相关性(例，%)

2.3 影响因素分析

在观察组中，以Galectin-3、Cytokeratin-19阳性表达作为因变量，以调查的临床资料作为自变量，多因素非条件logistic回归分析显示PTC组织病理分期、分化程度、淋巴结转移都为影响Galectin-3、Cytokeratin-19阳性表达的独立危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 影响PTC组织Galectin-3、Cytokeratin-19阳性表达的主要因素(n=30)

3 讨论

PTC是一种高度遗传特异性的恶性肿瘤。早期PTC的预后较好，但晚期预后较差，特别是其发生转移时，很难被彻底根治[16]。近年来，通过对PTC相关基因进行分析，可以为预测PTC的预后提供有力的而可靠的证据。癌基因激活和抑癌基因失活均可导致正常组织发生癌变，通过单个抑癌基因或癌基因的检测分析有助于分析肿瘤的发生与发展[17]。不过目前多数研究仅局限于单一指标，然而从生物学角度看，各指标之间可能存在着极其复杂的关系[18-19]。

细针穿刺涂片因操作简便、经济、快速、安全、实用等特征，现已被广泛应用于临床并已成为甲状腺结节术前诊断的常见检查手段之一[20]。Galectin-3是由氨基酸末端区和羧基末端糖类识别区组成的多肽，可存在于细胞质、细胞核、细胞表面中，属凝集素蛋白家族成员。有研究表明Galectin-3诊断甲状腺结节良恶性的敏感性大于80%，特异性大于90%[21]。Cytokeratin-19是一类低分子量角蛋白，可表达于许多上皮组织中，Cytokeratin-19可高表达于PTC，阳性率在80%以上[22]。本研究显示Galectin-3、Cytokeratin-19在对照组的阳性表达率为15.6%和4.4%，在观察组中的阳性表达率为80.0%和90.0%，观察组都高于对照组(P<0.05)，表明随着甲状腺组织的恶化，Galectin-3、Cytokeratin-19蛋白相对表达量越来越高。病理类型、临床分期相同的PTC患者，采用相同的治疗方案却得到不同的预后，为此需要积极建立更加有效的PTC判定诊断方法，从而指导PTC的临床工作[23]。Galectin-3、Cytokeratin-19可参与多项生物功能，包括细胞凋亡、肿瘤发展、细胞粘合、细胞周期调节等。Galectin-3、Cytokeratin-19高表达导致细胞凋亡程序受阻，导致细胞向恶性发展，而抑制其表达可以使发生转化的细胞正常[24]。本研究显示Galectin-3、Cytokeratin-19在PTC组织中的阳性表达率与PTC的病理分期、分化程度、淋巴结转移明显相关(P<0.05)；Spearman 等级相关分析显示PTC的Galectin-3、Cytokeratin-19的阳性表达呈明显相关性(γ=0.607，P<0.05)。也有研究表明有Galectin-3、Cytokeratin-19高表达的肿瘤更具有侵袭性，与PTC患者的肿瘤大小、淋巴结转移呈显著正相关[25]。而如果肿瘤组织分裂旺盛，处于细胞周期活跃期的细胞相对较多，是Galectin-3、Cytokeratin-19表达增高所致[26]。

随着遗传学损伤的不断积累，更多的抑癌基因失活而大量的癌基因被激活后，在外界环境的双重作用下，导致PTC的发生[27-28]。本研究多因素非条件logistic回归分析显示PTC组织病理分期、分化程度、淋巴结转移都为影响Galectin-3、Cytokeratin-19阳性表达的独立危险因素(P<0.05)。当前临床上也出现了评估Galectin-3、Cytokeratin-19鉴别滤泡状肿瘤良恶性的诊断价值的大型前瞻性研究，利用穿刺涂片组织标本进行Galectin-3、Cytokeratin-19检测，进一步提升了其临床可信度[29-30]。

总之，Galectin-3、Cytokeratin-19在PTC组织中呈现高表达状态，与组织的病理分期、分化程度、淋巴结转移明显相关，可作为判断PTC患者病情的重要指标，有很好的应用价值。