环形RNA在原发性肝细胞癌中的研究现状及展望

廖 艳，陈 谱，廖维甲,3*

(1.桂林市疾病控制中心，广西 桂林541001；2.桂林医学院附属医院 肝胆外科实验室，广西 桂林541001；3.广西肝损伤与修复分子医学重点实验室，广西 桂林541001)

随着高通量测序及生物信息学等领域快速发展，越来越多的环形RNA(CircRNA)在生物体内被发现。CircRNAs具有microRNA(miRNA)“海绵作用”、调控亲本基因表达、与蛋白质相互作用及翻译成蛋白质发挥效应等重要的生物学功能。近几年来，其在包括肝细胞癌(肝癌)在内的肿瘤中的作用被人们所重视及研究，本文旨在结合国内外目前的研究报道，对CircRNAs在肝癌中的研究现状进行综述，并探讨其在临床应用中可能的潜在价值。

环形RNA(circular RNA,CircRNA)是一类不具有5’末端帽子和3’末端Poly(A)尾巴，由非经典剪接方式进行反向剪接，以共价键形成环形结构的非编码RNA分子[1,2]。广泛存在于人体及动植物细胞中，并参与多种生物过程。因其呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解[3]。

肝细胞癌(肝癌)是肝脏恶性肿瘤常见类型，它是全球范围内最常见、且死亡率极高的恶性肿瘤之一，具有一定的地区分布特性，在亚洲、非洲和欧洲南部等为高发区。由于病毒性肝炎感染、酗酒和肥胖等因素的影响，全球肝癌的发病率仍然呈现上升趋势[4]。资料显示，肝癌预后普遍不佳，其术后5年复发转移率高达60%-70%[5,6]；另一方面，临床上仍然缺乏可靠的早期诊断及预后预测的指标和措施。目前，血清甲胎蛋白(AFP)值仍然是肝癌早期诊断及复发监测常用的有效指标，但存在明显的敏感性与特异性不足，而不能满足临床需要。有研究提示，血清AFP对小肝癌基本上没有诊断及预后监测价值[7]，因而，迫切需要新的、更理想的标记物来改善目前对肝癌病人早期诊断、复发监测及预后预测能力[8]。近年来研究发现，CircRNAs具有疾病特异性、組织特异性、稳定等特性，且在血浆中含量丰富，这使得CircRNAs可能在作为疾病的生物标志物和治疗靶标等方面具有天然优势。部分CircRNAs影响着肝癌的发生、发展，并呈现出潜在的应用价值。本文旨在结合目前的研究报道，重点针对CircRNAs在肝癌中的研究现状进行综述。

1 CircRNAs的分类

根据其来源不同可大致将CircRNAs分成4种类型：外显子CircRNAs(ecircRNAs)、内含子CircRNAs(ciRNAs)、外显子-内含子CircRNAs(EIciRNAs)和转运RNAs内含子CircRNAs(tricRNAs)，占绝大部分的是外显子来源的ecircRNAs[9]。ecircRNAs一般是由pre-mRNA的内含子序列形成碱基互补配对形成，或由RNA结合蛋白(RNA-binding protein,RBP)介导的内含子配对出现后进行反向剪接形成[10]；ciRNAs则主要是由pre-mRNA内含子配对后进行反向剪接形成，或是由经典剪接途径将内含子剪切后，其下游5’ 端剪接位点进攻上游3’ 端剪接位点形成内含子套索形成[11]；EIciRNAs一般是通过RBP介导或非RBP介导的内含子配对后的环化作用形成[12]；而tricRNAs则是通过tRNAs剪接内切酶复合体在凸起-螺旋-凸起(bulge-helix-bulge,BHB)位点切割含有内含子的前体tRNAs(pre-tRNAs)后内含子的末端连接形成，外显子部分则连接形成成熟的tRNAs[13]。

2 CircRNAs在疾病中的作用与功能

2.1 CircRNAs具有microRNA(miRNA)“海绵作用”

microRNAs(miRNAs)是一类约22 nt大小的非编码RNA，能够通过直接与mRNAs的3’-UTR结合，对靶基因进行转录后调控[14]。CircRNAs中外显子来源的ecircRNAs可作为miRNA海绵，通过其多个串联的结合位点吸附特定的miRNAs来影响调节miRNAs的活性[15]。

2.2 CircRNAs可调控亲本基因的表达

外显子来源的CircRNAs在细胞质内发挥调节作用，而内含子来源的CircRNAs(如ciRNAs和EIciRNAs)大多位于细胞核中，执行转录调控顺式元件的功能。抑制ciRNAs的表达能够导致其亲本基因表达下调[16，17]。

2.3 CircRNAs与蛋白质相互作用和翻译成蛋白质发挥效应

CircRNAs可直接与蛋白质结合，也可通过RNA介导间接与蛋白质发生关联，影响蛋白质功能[18]。例如，Circ-Amotl1能与c-myc、STAT3、PDK1和AKT1等蛋白互作，并通过促进这些蛋白的核转位来影响其靶基因的表达[19-21]；有研究表明，包含有完整开放阅读框(ORF)的内源性CircRNA，Circ-ZNF609在肌生成过程中能通过剪接依赖和帽独立的方式被翻译成蛋白质并发挥效应[22]。

2.4 其他

除以上作用与功能外，CircRNAs还是pre-mRNA的调节剂，CircRNAs还可以作为RBP海绵，它在肿瘤免疫和免疫调节中也发挥着重要的作用等[23]。

3 CircRNAs在肝癌中的研究现状

目前，CircRNAs作为miRNA分子海绵在肝癌研究中报道的不多。其中，在肝癌中上调的主要有：CiRS-7、Circ_0067934、CircRNA_100338和Hsa_circ_00005075等几个。CiRS-7是包括肿瘤在内的人类疾病中目前报道较多的一个CircRNA。CiRS-7主要是作为海绵，抑制miR-7活性并与miR-7竞争结合其他RNA(包括mRNA和lncRNA)[16,24]，解除或减轻miR-7对致癌分子(诸如IRS-1、IRS-2、Pakl和Rafl等)抑制作用，导致致癌分子表达量增加，促进肿瘤的进展。而在肝癌中也存在类似的情况，高表达CiRS-7促进肝癌细胞的微血管侵犯，并通过miR-7对下游靶分子p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)和PIK3CD的调控发挥作用[25]。Circ_0067934则是通过抑制miR-1324和FZD5/Wnt/β-连环蛋白信号通路激活来增强肝癌细胞的增殖，迁移和侵袭[26]。CircRNA_100338的肝癌患者有不良的预后、容易发生转移等，其机制是CircRNA_100338作为miR-141-3p分子海绵，影响肝癌细胞的侵袭性[27]；而Shang等[28]发现Hsa_circ_00005075表达上调水平与肿瘤大小正相关，受其作用的miRNAs包括 miR-23b-5p、miR-93-3p、miR-581和miR-23a-5p等。

在肝癌中下调的主要有：CircMTO1、Hsa_circ_0001649、Hsa_circ_0004018、circZKSCAN1、cSMARCA5等几个。Han等[29]发现CircMTO1(Hsa_circRNA_0007874/Hsa_circRNA_104135)与肝癌患者生存期和预后密切相关，其机制是CircMTO1作为miR-9的分子海绵，靶向结合miR-9并上调受miR-9调控的p21的表达，继而抑制肝癌细胞的生长与侵袭；Qin等[30]则发现Hsa_circ_0001649表达与肿瘤大小相关。而Hsa_circ_0004018的低表达与AFP水平，肿瘤大小，组织分化，巴塞罗那分期(BCLC)和肿瘤淋巴结转移(TNM)分期等相关，作用的miRNAs包括 miR-30e-5p、miR-647、miR-92a-1-5p、miR-660-3p和miR-626等[31]。此外，Yao等[32]发现沉默circZKSCAN1能促进细胞增殖，迁移和侵袭，相反地，过表达则能抑制肝癌进展。CircZKSCAN1则参与几个癌症相关的信号通路的调控，它们相互合作以抑制肝癌的生长，迁移和侵袭；Yu等[33]则发现cSMARCA5下调水平与肝癌细胞侵袭性特征显著相关，且为肝癌患者术后总体生存率(OS)和无复发生存率(RFS)的独立危险因素，其机制为cSMARCA5可以通过结合miR-17-3p和miR-181b-5p促进肿瘤抑制因子(TIMP3)的表达，进而抑制肝癌细胞的增殖和迁移。

除了分子海绵功能外，CircRNAs还具有一定的蛋白调控功能。Li等[34]通过GREAT将候选CircRNAs与蛋白质编码基因(PCG)相关联，发现与这些候选CircRNAs相关的PCG在正常和肿瘤样品之间具有差异性表达模式。这些PCG主要富集肝脏、心血管相关疾病，如动脉粥样硬化，心肌缺血和冠心病，并参与各种代谢过程。进一步的网络分析表明，这些PCGs在监管和蛋白互作网络(PPI)中起着重要的作用。分别利用候选的CircRNAs及其相关基因建立了区分正常和肿瘤样本的分类模型。结果表明CircRNAs可能是肝癌发生的关键因素，为探索肝癌的发病机制提供了有用的资源。另有研究，Yang等[35]发现小脑变性相关蛋白1反义RNA(CDR1as)，一种致癌性CircRNA，在肝癌细胞中找到了增强CDR1as表达的330个差异表达蛋白(DEP)，表明它们可能是由CDR1as调节的蛋白质。后续研究发现，CDR1as至少部分通过调节EGFR表达发挥其对细胞增殖的作用。此外，又进一步证实CDR1as可以抑制miR-7的表达。鉴于EGFR是miR-7的有效靶点，因而，CDR1as可能通过在肝癌细胞中靶向miR-7调节EGFR表达来发挥其功能。这项研究作为细胞中CircRNA-调节蛋白的有效方法得到验证。

CircRNAs也可以通过影响一些细胞的生物学功能来影响肝癌的发生、发展。Zhang等[36]发现与CD90- 细胞相比，从SKHep1细胞中分离出来的CD90+细胞具有更高生存能力、迁移能力和侵袭能力，进而采用微阵列检测CD90+ 和CD90- 细胞的CircRNA表达谱，发现其中之一Hsa_circ_0067531表达水平不同；而在肝癌组织中hsa_circ_0067531的表达与相邻正常组织相比明显降低。这提示Hsa_circ_0067531可能是通过影响CD90+ 肝癌细胞的生物学功能，来影响肝癌的发生、发展。

此外，肝癌的特点之一是发病率存在明显的性别差异，雄激素受体(AR)被认为在其中起到关键作用。研究发现AR可以结合到RNA编辑酶ADAR1的启动子区上调ADAR1 p110的转录，从而抑制CircRNAs的表达。如，CircARSP91(Hsa_circ_0085154)是受AR-ADAR1调控导致下调的CircRNA，并体内、外实验证实能抑制肝癌细胞的生长。这些研究结果表明，AR可以通过调控ADAR1的表达，从而抑制CircRNAs表达，影响肝癌的发生发展[37]。

4 CircRNAs在肝癌中的研究展望与存在的问题

4.1 一种新型的生物标记物

上述相关研究发现，某些CircRNAs可能是肝癌诊断、预后预测和治疗等重要相关的、潜在的新型生物标记物和靶点。CircRNAs作为一种生物体内含量丰富、稳定、保守和结构多样等，基于其首尾相接成环的结构特点，不易被RNA酶等核酸酶降解，这些都提示circRNA在诸多的生埋、病理过程中可能具有重要的生物学功能，有望在疾病诊断和治疗中具有重要的临床应用价值。

4.2 为肝癌的研究治疗开辟新道路

虽然CircRNAs在肝癌发生、发展中的很多机制和功能还不明确，但已经有部分研究显示，CircRNAs可通过miRNA分子海绵功能，蛋白调控功能，和影响一些细胞生物学功能等方式来影响肝癌的发生或发展。那么，我们不仅可把其作为生物标记物来监测，也可以反过来改变其表达来对肝癌的发生或发展进行干预。若暂时无法做到直接改变其表达，也可通过间接的方式，如AR可以通过上调ADAR1 p110来抑制CircRNAs的表达。通过这种干预，是否能为肝癌等疾病的研究治疗开辟新道路。

4.3 现阶段主要需要解决的问题

CircRNAs在疾病中的作用、功能及机制还不明确，现阶段还有很多问题需要解决。如何精准预测CircRNAs作为海绵分子所对应的miRNAs，并通过大量准确的实验数据来验证，以此来建立起关于CircRNAs作为miRNA海绵分子的网络库，这还有一段很长的路要走。另外CircRNAs作为转录调控顺式元件的功能，或有可能作为反式作用因子的功能，其能通过与关键蛋白结合来调控肿瘤发展的功能，甚至其本身都具有翻译成蛋白或多肽的潜能等功能，值得深入研究。