Wistar大鼠自然衰老过程中口腔颊黏膜上皮厚度的改变*

孙 凯 刘丽骏 张倩倩 蒋伟文

衰老是随着年龄的增大，生物发生的结构功能开始发生退行性变的一种趋向死亡的不可逆转的现象[1]。目前，针对全身衰老的研究是国际研究的热点。学者们已建立了多种全身衰老的动物模型，揭示了衰老相关的分子机制和信号通路，并发现针对其进行相关干预可以延长动物寿命。与成熟的全身衰老研究相反，衰老与口腔黏膜疾病的机制研究并没有引起足够关注。实际上，衰老对口干症等口腔疾病的发生密切相关[2]，而口干则会继发牙周病、根面龋等疾病，出现牙齿松动脱落或冷热酸痛等症状，影响进食，从而对全身营养摄入产生不利影响。遗憾的是，国内外尚无针对口腔黏膜衰老的动物模型。因此，建立一个口腔黏膜衰老的动物模型，为防治口腔黏膜衰老相关疾病提供工具,具有很强的科学意义。

目前，学者们对口腔黏膜上皮增龄性改变的结论并不一致。Scott等发现随着年龄增加，人舌腹被覆黏膜上皮厚度减少约30%左右[3]。Sakai等发现在鼠牙龈细胞和结合上皮细胞并没有增龄性变化[4]。理论上说，采用自然衰老鼠进行衰老研究最符合人类衰老的特点。在大鼠的生长过程中，其月龄与人年龄有着对应的关系(表1)。目前，老年动物饲养周期长和易死亡是其模型建立的两大瓶颈。据此，我们拟研究Wistar大鼠自然衰老过程中口腔颊黏膜上皮厚度的改变，为口腔黏膜人工衰老模型的后期开发提供自然衰老鼠的对照数据。

表1 大鼠月龄与人年龄对应关系图

1.材料和方法

1.1 材料 实验鼠选用雄性Wistar大鼠。3月龄鼠3只，作为青年组；12月龄鼠3只，作为中年组；24月龄鼠3只，作为老年组。本研究所涉及大鼠均来源和饲养于上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物中心[使用许可合格证号SYXK(沪)2012-0007]。饲料选用有生产许可证的商品饲料，经Co60消毒后使用。饮用水为无菌过滤水。设施内动物换气次数每小时8～15次，氨浓度＜20ppm，相对湿度40%～80%，滤过后空气洁净度为10000级，噪声＜50dB，温度20℃～23℃。本研究已获上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会批准[伦理号：沪科动伦(2018)59]。

1.2 方法 将Wistar大鼠饲养至相应月龄后，称取体重，按0.4ml/100g的剂量于腹腔注射水合氯醛进行麻醉。待麻醉起效后，取鼠口腔自口角向内的颊黏膜组织，大小约为1cm×1cm，深度5mm，放入福尔马林中浸泡24h，石蜡包埋，4μm切片，行苏木精伊红(Hematoxylin/Eosin，HE)染色。染色具体步骤为：苏木精染色2min；流水冲洗2min；1%盐酸酒精作用2s；流水冲洗10s；氨溶液复蓝15s；流水冲洗5min；80%酒精作用20s；1%伊红液染色15s；95%酒精作用20s；95%酒精作用20s两次；二甲苯作用3min两次。

将HE染色载玻片于正置显微镜下400倍放大的视野中观察，每张玻片随机取5个视野，测量自上皮钉突处基底层底端至粒层顶端的厚度和自粒层顶端至角化层顶端的厚度(图1)，该两项指标分别代表了上皮增殖和成熟的能力。

图1 上皮厚度主要观察指标示例

1.3 统计学分析 我们采用了SPSS17.0软件进行数据统计，三组间比较首先进行方差齐性分析。如方差齐采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验，结果用均数±标准差表示。如方差不齐采用非参数检验，结果用中位数±四分位数间距表示。P＜0.05代表差异具有显著性。

2.结果

通过对Wistar大鼠口腔颊黏膜上皮进行的HE染色发现，老年组的上皮角化层、粒层的层数大于青年组或中年组，青年组和中年组之间差异不明显(图 2)。

老年组的Wistar大鼠口腔颊黏膜上皮基底层至粒层平均厚度为125.1±34.4μm，中年组的平均厚度为77.2±51.0μm，青年组的平均厚度为65.9±27.4μm，老年组显著高于青年组(P＜0.001)和中年组(P=0.004)(图3A，单因素方差分析)。

同样地，在鼠上皮角化层方面，老年组的平均厚度为50.1±31.1μm，中年组的平均厚度为16.3±15.4μm，青年组的平均厚度为16.4±12.5μm，老年组显著高于青年组(P＜0.001)和中年组(P＜0.001)(图3B，单因素方差分析)。

图2 Wistar大鼠口腔颊黏膜上皮HE染色(×400)

图3 上皮厚度的增龄性变化散点图

3.讨论

目前，口腔黏膜衰老的机制并不明确。口腔黏膜衰老鼠模型可为口腔黏膜衰老机制的研究提供新的工具。然而，老年自然衰老鼠具有饲养周期长的缺点，而现成的老年鼠不易获得。本研究自上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物中心购买得目前市场上能够得到的年龄最大的12月龄Wistar大鼠，并将其饲养12月从而获得24月龄老龄鼠。因此，本研究获得老年鼠的上皮厚度的增龄性变化数据显得十分珍贵。

十年前，巴西学者曾研究了雌性家鼠舌背这一黏膜上皮厚度的增龄性变化[5]，发现角化层厚度在中年和老年鼠中显著高于青年组，这与本研究在颊黏膜中的结果一致，可能与老年鼠进食时间较长所引起的过角化有关。不同的是，巴西学者发现基底层至粒层厚度随月龄增加出现降低的趋势，而我们则发现随月龄增加出现升高的趋势，这可能与取材黏膜类型和实验鼠种类不同有关。

本研究仍有一定的局限性，如青年、中年、老年鼠数量各仅有3只，增加了结果的不确定性，今后可适当增加每组样本数量。在时间分布上，许多研究仅设置2个研究时间点[6-8]，即青年和老年，本研究观察的时间点为3个，今后的研究可再适当增加观察时间点，以获得更有月龄连续性的统计数据。目前，人工衰老鼠模型包括D-半乳糖给药法、臭氧损伤法和去除胸腺法等的研究已较为成熟，未来可尝试进行人工衰老造模，以期获得更多的口腔黏膜衰老研究工具。