炎症微环境对牙周膜干细胞氧化应激和线粒体生成的影响*

蔡川黄也王婧薛芃徐娟张彤徐璐璐

牙周膜干细胞(PDLSCs)具有自我更新及多向分化能力，是牙周组织再生的理想种子细胞之一[1]。牙周炎是一种由牙周致病菌引发的影响牙齿支持组织的炎症性疾病。牙周炎状态下PDLSCs的生物学功能受到损害，导致牙周组织再生修复能力下降[2]，因此，探索牙周炎症微环境导致PDLSCs生物学功能受损机制、促进PDLSCs的牙周再生能力是学者们关注的热点。

近年来，很多学者发现牙周炎和许多全身性疾病有显著关联性，并且提出了这些疾病的共同发病机制——氧化应激[3,4]。氧化应激是指机体在受到各种有害刺激时，体内活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)产生过多，从而导致组织损伤。线粒体是细胞能量代谢的场所，其氧化磷酸化作用是细胞内ROS的主要来源。线粒体ROS可以通过改变氧化还原反应的状态来起介导信号调节的作用，从而决定干细胞的自我更新和分化[5]。

肿瘤坏死因子 -α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在牙周炎发病中起重要作用。TNF-α促进中性粒细胞和单核细胞更易于粘附至血管壁，并通过趋化作用移行至炎性组织内，导致更多炎性介质产生。同时，TNF-α能够刺激成纤维细胞胶原酶的产生，造成牙周组织损害[6]。

目前关于PDLSCs在炎症微环境下的氧化应激状态及其机制的研究尚未见报道。本研究培养了正常及慢性牙周炎来源的PDLSCs，研究了炎症微环境对PDLSCs氧化应激及线粒体生成的影响，以期更好地调控细胞特性，抵抗氧化应激，从而有益于牙周组织再生。

1.材料和方法

1.1 材料 胎牛血清，α-MEM培养基，Ⅰ型胶原，0.25%胰蛋白酶，青链霉素(美国Gibco)，TNF-α(美国 Peprotech)，MitoSOX Red 线粒体ROS检测试剂盒(mp36008，美国 Invitrogen)，DCFH-DA(二氯荧光黄双乙酸盐)ROS检测试剂盒(mp36013，美国Invitrogen)，实时定量PCR仪Applied Biosystems 7500(美国)，RNA抽提试剂盒及逆转录试剂盒(美国Invitrogen)，Taq DNA聚合酶、dNTPs和引物(上海生物工程公司)，Syber Green荧光定量PCR检测试剂盒(大连宝生物)，Western及IP裂解液，BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天)，ERRα、PGC-1α、PGC-1β、MFN2、SOD2(美国Abcam)，GAPDH 抗体，羊抗兔IgG(北京中杉金桥)。

1.2 样本收集与细胞分离培养 经解放军总医院伦理委员会批准，患者知情并签署同意书后，获得因正畸需要拔除的健康牙以及因慢性牙周炎二型骨吸收拔除的患牙。患者年龄32～40岁，男女各半，其中收集健康离体牙样本6颗，慢性牙周炎离体牙样本8颗。所有纳入个体均无系统性疾病及已知可以影响牙周状况的疾病，无吸烟史，近6个月无特殊服药史。牙齿拔除后立即放入含双抗的α-MEM中。使用含双抗的PBS反复冲洗，刮取根中下1/3牙周膜，采用组织块+胶原酶法培养原代细胞，培养约3～7d后细胞从组织中爬出，达到80%汇合度时用胰酶消化传代。采用有限稀释法培养PDLSCs，消化收集第一代细胞，调整细胞密度为10个/mL，将细胞悬液加入96孔板，使每孔细胞悬液中约有1个细胞。24 h后在倒置显微镜下观察，挑选单细胞贴壁孔，待孔中细胞形成较大克隆，合并多个单克隆来源的细胞悬液，体外扩大培养。采用第3～4代多克隆PDLSCs用于实验研究。参照以往研究进行H-PDLSCs和P-PDLSCs的干细胞标志物与生物学特性检测[7]。实验分组为健康牙周膜干细胞(H-PDLSCs)组、炎症牙周膜干细胞(P-PDLSCs)组和TNF-α(作用时间7d，浓度参考以往研究选用10ng/mL[8])作用于健康牙周膜干细胞(T-PDLSCs)组。

1.3 荧光探针检测线粒体和全细胞ROS水平以无血清培养液分别稀释MitoSOX和DCFH-DA(1∶1000)，使终浓度为 5μmol/L 和 10μmol/L，加入培养各组细胞的96孔板中，每孔加入200μL。37℃避光孵育30min，PBS洗涤2次后，用DAPI标记细胞核后孵育10min，再次洗涤后，在荧光显微镜下观察。细胞MitoSOX荧光强度激发波长510nm，发射波长580nm，DCFH-DA激发波长495nm，发射波长525nm。利用Image pro plus图像分析软件测量细胞灰度，每个样品检测30个细胞，所有样品拍摄条件固定。

1.4 实时定量PCR检测 用Trizol裂解细胞并提取总RNA，测定RNA浓度，分别反转录为cDNA，利用Syber Green荧光定量PCR检测试剂盒进行荧光定量PCR检测，反应体系均为20μl。反应条件：变性20min，95℃30s，60℃1min，40个循环。引物通过https://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站的Primer-BLAST设计。引物序列与Refseq ID如下：

ERRα(NM_004451)：Forward：5’-AGGGTTCCTCGGAGACAGAG-3’，Reverse： 5’-TCACAGGATGCCACACCATAG-3’；PGC-1α(NM_01326)：Forward：5’-TCTGAGTCTGTATGGAGTGACAT-3’，Reverse：5’-CCAAGTCGTTCACATCTAGTTCA-3’； PGC-1β (NM_133263)：Forward：5’-GATGCCAGCGACTTTGACTC-3’，Reverse：5’-ACCCACGTCATCTTCAGGGA-3’；TIMM13(NM_012458)：Forward：5’-CAGAGGATGACGGACAAGTGT-3’，Reverse： 5’-CATGTAGCGGTCCATGCACA-3’；MFN2(NM_014874)：Forward：5’-CTCTCGATGCAACTCTATCGTC-3’，Reverse：5’-TCCTGTACGTGTCTTCAAGGAA-3’；SOD2(NM_001322820)：Forward：5’-GCTCCGGTTTTGGGGTATCTG-3’，Reverse：5’-GCGTTGATGTGAGGTTCCAG-3’； PRDX3(NM_001302272)：Forward：5’-ACAGCCGTTGTCAATGGAGAG-3’，Reverse：5’-ACGTCGTGAAATTCGTTAGCTT-3’；GAPDH(NM_001289746)：Forward：5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’，Reverse：5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’。

1.5 Western blot检测 采用细胞裂解液试剂盒提取各种细胞膜中的总蛋白，BCA法测定蛋白样本浓度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，将凝胶中的蛋白在转移电泳槽中转至PVDF膜。用TBST缓冲液配制的含有5%脱脂奶粉的封闭缓冲液对PVDF膜封闭2h，PVDF膜封闭ERRα、PGC-1α、PGC-1β、MFN2、SOD2 抗体(1∶ 1000)稀释，4℃过夜。洗膜3次后加入相应浓度的二抗，室温条件下封闭2h，洗膜3次。在Bio-Rad凝胶成像仪中获取蛋白条带图像，图像分析软件分析各样品目的条带的灰度值。

1.6 流式细胞术 消化收集各组细胞，分别以MitoSOX和DCFH-DA孵育，调节细胞密度为5×106/mL，每个样品采集10000个细胞。使用流式细胞仪检测荧光强度。

1.7 统计学分析 每个实验组设置3个平等样本，每个样本重复检测3次取均值。采用SPSS 17.0软件进行统计，计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 炎症微环境提高PDLSCs线粒体和全细胞ROS水平 正常及炎症牙周膜组织来源的PDLSCs在原代与有限稀释法克隆培养后，分为三组(H-PDLSCs组，P-PDLSCs组，T-PDLSCs组)培养7d。光学显微镜下观察三组细胞形态无明显差异，均呈梭形、贴壁生长(图1)。

图1 H-PDLSCs，P-PDLSCs和T-PDLSCs细胞培养(第4代细胞，培养3天，图中标尺=50μm)

荧光显微镜观察和流式细胞术检测荧光染色水平，其中MitoSOX荧光强度结果反映线粒体ROS水平(图2)，DCFH-DA荧光强度反映全细胞 ROS水平(图 3)。H-PDSLCs组细胞MitoSOX和DCFH-DA荧光显色区域均局限于细胞核周围(图2A，图3A)而P-PDLSCs组合T-PDLSCs组两种荧光强度和范围都明显增大。两组细胞的流式细胞术检测结果相似(图2B，图3B)：与H-PDLSCs相比，P-PDLSCs和T-PDLSCs组的ROS水平均有显著升高。T-PDLSCs组升高程度不及P-PDLSCs组，但不具有统计学意义。结果表明，炎症微环境促进了线粒体ROS水平的提高，进而促进了全细胞ROS水平的提高。

2.2 炎症微环境降低PDLSCs线粒体生成与抗氧化水平 实时定量PCR结果显示(图4)：ERRα、PGC-1α、PGC-1β、TIMM13、MFN2、SOD2 和PRDX3的mRNA表达水平在P-PDLSCs中均有显著降低，ERRα、PGC-1α、TIMM13、MFN2、SOD2和PRDX3的mRNA表达水平在T-PDLSCs中也有显著降低。Western blot结果显示(图5)：ERRα、PGC-1α、PGC-1β、MFN2 和 SOD2 蛋白表达水平在P-PDLSCs组中显著下调，而在T-PDLSCs组中各蛋白表达也有所下调，仅MFN2蛋白水平与H-PDLSCs组相比没有统计学意义。

图2 MitoSOX检测线粒体ROS水平

图3 DCFH-DA检测全细胞ROS水平

图4 实时定量PCR检测三组细胞线粒体生成相关基因ERRα、PGC-1α、PGC-1β、TIMM13、MFN2和抗氧化基因SOD2和PRDX3的mRNA表达情况(**P＜ 0.01，*P＜ 0.05 vs.H-PDLSCs)

图5 Western blot检测三组细胞ERRα、PGC-1α、PGC-1β、MFN2、SOD2蛋白表达情况(**P＜ 0.01，*P＜ 0.05 vs.H-PDLSCs)

3.讨论

影响PDLSCs生物学特性的因素很多[9]，炎症是最常见的影响干细胞微环境的体内因素之一。研究表明，患有牙周炎的PDLSCs经体外分离培养后仍具有一定的炎症特性[2]，这有助于研究炎症微环境对PDLSCs生物学功能的损害。牙周炎被认为是菌斑刺激下局部牙周组织产生的过度免疫反应，其中菌斑最主要的产物脂多糖可刺激宿主细胞产生炎性因子，如TNF-α、白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6等。鉴于TNF-α在牙周炎发病中的重要作用，本实验设置了TNF-α单独处理组，结果证实该因子对健康PDLSCs生物学功能的损害与炎症来源的PDLSCs效应相似。

近年研究认为，氧化应激的直接和间接参与是导致牙周组织破坏的关键因素，牙周炎不仅是氧化应激相关的全身疾病的局部表现，也可以通过氧化应激来促进这些疾病的进展[10,11]。氧化应激是因ROS生成过多，破坏了与抗氧化机制间的平衡，从而导致潜在病例损伤的过程。生理水平的ROS参与调控细胞内环境稳态、信号转导、凋亡等生理活动，而过量ROS则产生细胞毒性，对蛋白质、脂质、DNA造成氧化损伤，干扰细胞生长和细胞周期进程，并诱导细胞凋亡。ROS还能通过激活炎性因子、核因子κB(NF-κB)、c-Jun氨基末端激酶(JNKs)及自噬改变牙周微环境而对牙周组织造成间接的严重破坏[12]。牙周炎的始动因素是细菌，而细菌对宿主的侵袭导致了ROS的产生。研究表明，干细胞的功能与线粒体和ROS有重要联系，例如间充质干成骨分化过程中，线粒体生物合成增加、氧化作用增强，同步伴随着抗氧化能力的提高[13]。因此，本研究检测了炎症微环境以及炎症因子TNF-α的作用对PDLSCs氧化应激的影响，发现两种条件确实显著提高了PDLSCs的ROS水平。我们选择了两种荧光探针MitoSOX和DCFH-DA分别检测线粒体和全细胞ROS水平。两种检测结果的相似性证实线粒体是正常状态下细胞ROS生成的主要场所，而炎症微环境主要通过提高线粒体ROS水平提高了全细胞的ROS水平。

为探索炎症微环境促进氧化应激的机制，我们进一步对线粒体合成及抗氧化相关基因表达水平进行了检测。雌激素相关受体(estrogen-related receptor，ERR)α属于核受体超家族中孤儿核受体家族的一员，其弱转录活性可被过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 辅激活因子 1α/β(PGC-1α/β)激活放大从而调控下游基因转录，在线粒体生物合成和能量代谢中起关键作用[14]。线粒体融合蛋白(mitofusin，MFN)2是线粒体外膜上的跨膜蛋白，介导线粒体融合[15]；线粒体内膜转运酶(translocase of inner mitochondrial membrane,TIMM)13是线粒体内膜的标记蛋白，这些蛋白表达水平的高低可在一定程度上说明线粒体的数量水平。本研究发现ERRα、PGC-1α/β、MFN2、TIMM13在炎症来源PDLSCs和TNF-α作用下的健康PDLSCs中均被下调，表明细胞线粒体生物合成功能受到影响，并推测可能会进一步影响细胞增殖、凋亡与自噬，但尚需进一步实验证实。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)2和硫氧还蛋白依赖的过氧化物还原酶(Peroxiredoxin-3,PRDX3)分布于线粒体内，能够清除呼吸链相关反应产生的O2-，并参与细胞增殖、分化与凋亡[16,17]。本研究中，P-PDLSCs与T-PDLSCs的SOD2和PRDX3表达显著降低，提示炎症微环境损害了线粒体内源性抗氧化防御机制。

综上所述，本研究表明，牙周炎症微环境提高了PDLSCs的ROS水平，影响了线粒体发生与抗氧化防御系统，从而对PDLSCs生物学功能造成损害。其进一步机制有待后续研究阐明，以求为基于PDLSCs的牙周组织再生治疗提供新的理论依据。