苏丹红I对大鼠CYP 2E1、CYP 3A1酶活性、CYP 450含量及血液成分的影响

单春兰，高飞龙，刘超英，刘海峰，高 洪*，严玉霖，杨 伟，王 浩

(1. 云南农业大学动物科技学院，云南 昆明 650201； 2. 云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201)

【研究意义】随着人类生活水平的不断提高，食品安全问题和自身健康问题越来越引起了人们的普遍关切。【前人研究进展】苏丹红I(Sudan I)是一种人工合成的亲脂性偶氮化合物，常用于工业生产中，其可通过多种途径代谢，在代谢过程中产生活性氧，主要作用与肝脏靶器官。Sudan I及其代谢产物能够导致细胞不断分裂和增殖，并能抑制细胞凋亡，从而促进肿瘤细胞的生长。Omura等在1964年于大鼠的肝微粒体中发现的酶系CYP 450s(Cytochrome P450s，CYPs)，分布于哺乳动物的肝、胃肠道、肾、脑、肺、皮肤及胎盘组织[1-2]。其中肝脏是其含量最高的场所，存在于肝细胞的内质网、线粒体和核膜上。CYP 450s是存在于肝脏内重要的药物代谢酶，主要参与了内源性物质和外源性物质在肝脏内的代谢，也是致癌物代谢活化的一类重要酶系[3-5]。CYP 2家族细胞色素中CYP 2E1可被乙醇等化合物诱导，是参与N-亚硝胺、苯胺、卤代烃类等多种前致癌物代谢为终致癌物的主要酶类[6]。CYP 3A能被多种化合物所诱导，在许多毒理学和药物代谢方面具有重要意义[7]。血液成分中的白细胞、红细胞、血小板和血红蛋白对机体发生病理改变最具有诊断参考价值[8]。白细胞是动物机体防御系统的重要组成部分，数目增高见于急性中毒、组织损伤、细菌病毒的感染等等；红细胞数目的减少见于造血发生障碍容易形成贫血或受到物理化学因素破坏；血小板量数目增高表现血液粘稠度增大，血栓形成等疾病；血红蛋白反应机体的贫血程度[9]。【本研究切入点】本实验研究拟用对照组(C组)、Sudan I处理组实验动物SD大鼠，建立肝脏病理性损伤的中毒动物模型。【拟解决的关键问题】采用酶活性的测定和血液分析探讨CYP 450s酶系活性的变化，对阐明Sudan I致肝损伤机理以及建立Sudan I中毒病理性评价标准等方面具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

苏丹红I(Sudan I)，购于国药集团化学试剂有限公司；氨基比林，购于上海国药公司；BCA蛋白定量测试盒，购于昆明峰大进出口有限公司；还原性辅酶II、红霉素，购于Roche公司；蔗糖、连二亚硫酸钠(保险粉)、氯化钙、硫酸、硫酸锌、醋酸胺、氢氧化钡、乙酰丙酮、甲酸、氯仿、异丙醇、乙醇等为国产分析纯试剂。

1.2 主要仪器

HWS-20型恒温水浴箱，购于江苏太仓市实验设备厂；PHB-3pH酸度计，购于宁波石浦海天电子仪器厂；LD4-2A型低速离心机，购于北京医用离心机厂；DANGERSJ-CJ-1F型超净工作台，购于苏州苏洁净化设备有限公司；Beckman 超速冷冻离心机，购于美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3 实验动物分组与处理

30只清洁级SD大鼠，体重140～160 g/只，雌(无孕)雄不拘，昆明医学院实验动物科提供。临床检查确认健康后，单笼预饲养3 d，自由饮水采食，编号并随机分为Sudan I处理组(I, II, III和 IV组)和C组，每组6只。

将Sudan I与饲料按一定比例充分混匀，配制成4个不同剂量的颗粒饲料，分别饲喂Sudan I处理组：I组(265 mg/kg)、II组(530 mg/kg)、III组(795 mg/kg)和 IV组(975 mg/kg)，连续饲喂10 d。C组饲以普通颗粒饲料，饲喂与处理组相同天数。

1.4 肝脏微粒体的制备

末次给药后，大鼠禁食12 h，处死大鼠后立即剖腹，取肝剪碎(本实验所用肝组织均为同一肝叶)，采用钙离子沉淀法制备肝微粒体，参照徐叔云等主编的《药理实验方法学》[10]提供的方法，用0.9 %生理盐水(0～4 ℃)反复冲洗肝脏，吸干后称重。取一定量的肝脏按1∶4加入0.25 mol/L蔗糖溶液制备20 %的组织匀浆，高速离心(4 ℃，12 500 r/min，25 min)，取上清液置离心管，加入88 mmol/L氯化钙溶液混匀，使其终浓度为8 mmol/L，静置5 min，轻轻颠倒数次，离心(4 ℃，27 000 r/min，15 min)，加入0.1 mol/L磷酸盐缓冲液洗涤沉淀，再次离心(4 ℃，27 000 r/min，15 min)，弃上清液，得到的粉红色沉淀即为微粒体，将其加入含20 %甘油的磷酸盐缓冲液中，-80 ℃冰箱保存备用。以上步骤均在冰浴上进行。

1.5 血液样品的采集

处死大鼠后，摘眼球采血，血液滴入含抗凝剂的离心管中，用于检测并分析血成分指标。

1.6 样品的测定

1.6.1 微粒体蛋白浓度的测定 采用BCA法测定微粒体蛋白浓度，以牛血清白蛋白为标准，严格按照试剂盒说明书操作，测得蛋白的含量。用公式(1)计算微粒体蛋白浓度。

蛋白浓度(g/L)=

(1)

1.6.2 CYP 450含量的测定 组织样品用磷酸盐缓冲液稀释，使其蛋白浓度大约为0.5 mg/mL，将待测组织样品中加入比色皿中。将配置好的0.1 g/mL连二亚硫酸钠(Na2S2O4)20 μl加入比色皿中混匀，静置30 s。取出比色杯，充CO气体40 s(速度应该缓慢，以气泡连续，液体不溢出为准)然后放回原位，1 min后测定450与490 nm处的吸光度差值。按公式(2)计算CYP 450的含量：

(2)

1.6.3 CYP 2E1、CYP 3A1酶活性的测定 甲醛标准曲线的建立：分别取0、25、50、100、150和200 μl的0.1 mmol/L甲醛溶液，各加入去离子水补至1 mL，再分别加入Nash试剂1 mL，50 ℃水浴30 min，冷却后，空白管调零，420 nm处测定OD值，以甲醛浓度为横坐标，OD为纵坐标，求出线性回归方程和相关系数r值。组织样品酶活性的测定操作(表1)。

表1 试剂、待测样品的剂量

空白管调零，420 nm处测定吸光度OD值，计算酶活性。根据标准曲线计算甲醛的浓度，酶活性按公式(3)计算。

酶活性(μmol/g/min)=

(3)

1.6.4 血液样品的测定 采用半自动血液细胞分析仪，测定血成分。

1.7 统计与分析

2 结果与分析

2.1 CYP 2E1和CYP 3A1酶活性的变化情况

2.1.1 甲醛标准曲线的绘制 分别取0、25、50、100、150和200 μl的0.1 mmol/L甲醛溶液，加入去离子水补至1 mL，则对应浓度分别0、2.5、5、10、15、20 μmol/L。420 nm处测定OD值，以甲醛浓度为横坐标，OD值为纵坐标，结果见表2。

从图1显示甲醛标准曲线，得到很好的线性关系，线性回归方程为y=0.0231x+0.0259，相关系数R2= 0.9926。

图1 甲醛标准曲线Fig.1 Standard curve of HCHO

2.1.2 CYP2E1、CYP3A1酶活性的变化 CYP 2E1酶在C、I, II, III和 IV组活性分别为132.17、164.5、211.67、209.00和203.67 nmol/g·min，结果显示Sudan I处理组CYP 2E1酶活性显著高于C组(P<0.01，P<0.05)；CYP 3A1酶在C、I, II, III和 IV组活性分别为24.83、47.33、50.17、70.33和68.33 nmol/g·min，显示CYP 3A1酶活性显著高于C组(P<0.01，P<0.05)。且在一定得剂量范围内，二者活性均有增长趋势。

2.2 CYP 450含量的变化

Sudan I处理组(I, II, III和 IV)的CYP 450含量显著高于C组(P<0.05)，且在一定得剂量范围内，随剂量上升而增加(表4)。

2.3 血液成分的变化

白细胞数目在Sudan I处理组(III和 IV)极显著高于C组(P<0.01)；红细胞数目在Sudan I处理组(II, III和 IV)显著低于C组(P<0.01，P<0.05)。血小板含量在Sudan I处理组(II, III和 IV)显著高于C组(P<0.01，P<0.05)；血红蛋白含量在Sudan I处理组(II, III和 IV)显著低于C组(P<0.01，P<0.05)。变化趋势为在一定剂量范围内，随Sudan I剂量的增加，白细胞数目增加，红细胞数目减少，血小板含量增加，血红蛋白含量减少(表5)。

3 讨 论

3.1 Sudan I对CYP 2E1、CYP 3A1酶活性及CYP 450含量的影响

进入体内的Sudan I在肝脏细胞的还原酶作用下被分解生产具有强烈毒性的1-氨基-2-奈酚和苯胺，可诱导细胞内核物质的损伤，或与 DNA、RNA 形成加合物[11]，会导致癌变，畸变的可能性，并且具有致敏性和遗传毒性等潜在威胁。严玉霖等[12]报道， Sudan I能引起肝脏组织细胞发生脂肪变性，能显著上调大鼠肝脏 CYP 1A1基因的表达，从而促进 Sudan I在体内代谢成有毒物质。机体发生中毒致使肝细胞及相应细胞器的损伤是无选择性，这主要是通过肝脏CYP 450s酶系代谢产生的毒性产物，如亲电子基、自由基、氧自由基等的作用引起线粒体、细胞核等生物膜脂质过氧化损伤，使膜流动性降低、通透性升高、膜酶活性改变、膜受体失活，从而破坏膜结构与功能，还会引起其他细胞器和整个细胞的变化，使细胞结构和功能破坏，失去膜的完整性[13-14]。CYP 2E1可被乙醇等化合物诱导，是参与N-亚硝胺、苯胺、卤代烃类等多种前致癌物代谢为终致癌物的主要酶类[6]细胞色素的合成和催化活性水平可随着接触的环境因素而改变，导致疾病易感性的不同。如果CYP450s代谢芳香族外源化合物，那么CYP 450s表现为活性增强，含量增加。

表2 甲醛浓度OD值

表3 大鼠肝微粒体CYP2E1和CYP3A1的活性

注：*和**分别表示在P<0.05或P<0.01水平下达到显著差异。下同。

Note:* and** indicated significant difference atP<0.05 orP<0.01 levels, respectively. The same as below.

表4 大鼠肝微粒体中CYP 450含量

采用酶活性的测定结果表明，Sudan I处理组CYP 450s含量明显高于C组，CYP 2E1、CYP 3A1酶活性在Sudan I不同剂量组显著高于C组，且随着剂量增加而呈上升趋势。在整个实验过程中，Sudan I处理组与C组相比，大鼠肝微粒体CYP 450s含量、CYP 2E1和CYP 3A1酶活性表现为增强。说明Sudan I影响了肝脏CYP 450s酶系统，而CYP 450含量、CYP 2E1和CYP 3A1活性的增强影响了肝脏细胞的正常功能，导致机体肝脏的损伤。

表5 SudanⅠ对大鼠血液成分的变化

3.2 SudanⅠ对血液成分的影响

机体血液在全身进行大小循环，流向各个组织器官，参与机体的新陈代谢，调节和维护机体各机能活动和内外环境的平衡，血液中的白细胞数、红细胞数、血小板量和血红蛋白量最具有诊断参考价值。白细胞是动物机体防御系统的重要组成部分，数目增高见于急性中毒；红细胞数目的减少见于造血发生障碍容易形成贫血；血小板量数目增高表现血液粘稠度增大，导致血液疾病的发生；血红蛋白反应机体的贫血程度[9]。测定血液中白细胞数、红细胞数、血红蛋白及血小板量结果表明，随着Sudan I处理剂量的增加，红细胞数和血红蛋白的量减少，白细胞数和血小板的量增加。显示Sudan I可改变血液成分中红细胞数、白细胞数、血红蛋白量和血小板量。暗示机体已经发生贫血和中毒。

4 结 论

研究结果表明Sudan I可促使肝CYP 450含量、CYP 2E1和CYP 3A1酶活性的升高，显示Sudan I对血液细胞数量变化有影响，并破坏了血液中的血红蛋白和血小板。在Sudan I致大鼠肝损伤的发生过程中，表明肝CYP 450、CYP 2E1和CYP 3A1发挥了重要作用，且对大鼠的造血机能产生了影响。