基于ERK-Calpain2通路探讨黄连素对冠心病大鼠心肌细胞凋亡的影响*

朱 娜，曹雪明

（1．河南省人民医院健康管理科，郑州 450000；2．河南省人民医院心内科，郑州 450000）

冠心病（CHD）近年来发病率逐年上升且日趋年轻化，它最直接的影响就是心肌缺血从而导致心脏的供氧减少，不能支持心脏正常工作，甚至导致部分心肌细胞凋亡[1-2]。研究报道，黄连素（BBR）可能通过促进抗氧化核转录因子Nrf2表达对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤后的凋亡发挥显著的抑制作用[3]。BBR可抑制细胞与调节蛋白激酶（ERK）1/2途径减轻大气细颗粒物对EA．hy926内皮细胞诱导的损伤凋亡[4]。这些提示黄连素对包括心肌细胞在内的多种细胞凋亡具有抑制作用。但BBR在抑制心肌细胞凋亡中的机制还不完善。因此，本研究通过建立CHD大鼠模型，观察BBR对模型动物心肌凋亡的作用，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD雄性大鼠30只，体质量（200±20）g，常州卡文斯实验动物有限公司，动物质量合格证号：No．201722172。

1.2 试剂 BBR（国药集团化学试剂有限公司），脑垂体后叶素（南京新百药业有限公司），含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-3、Caspase-12、钙蛋白酶（Calpain）2、钙蛋白酶抑制蛋白（Capastatin）、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）抗体及羊抗兔和羊抗鼠IgG-HRP二抗（美国CST公司），GAPDH抗体（Bioworld公司），RIPA裂解液、BCA试剂盒（碧云天生物技术有限公司）,PrimeScriptTM RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ荧光定量试剂盒及引物（大连TaKaRa公司）,一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（上海Beyotime公司）。

1.3 主要仪器 PIPETMANL微量可调加样器，法国Gilson公司；Allegra 64R Centrifuge台式高速冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司；CKX41倒置显微镜，日本Olympus公司；MiniVE电泳设备，美国GE公司；ABI Prism 7300型荧光定量PCR仪，美国ABI公司。

1.4 动物模型的建立及分组给药 参考文献[5]方法每日给予高脂食物连续喂养6周，间隔24 h腹腔注射垂体后叶素30 μg/kg，连续3次，建立CHD大鼠模型，并测定模型鼠心脏ST段变化，与正常鼠相比，心脏ST段变化明显升高的模型鼠为造模成功。将模型动物分为实验组和对照组，根据预实验结果，本研究实验组予以80 mg/（kg·d）BBR灌胃；对照组每日予以等体积的双蒸水灌胃。本实验同时以正常SD大鼠设立空白组，予以等体积的双蒸水灌胃。每组10只动物，治疗周期为12周。

1.5 实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）法检测心肌细胞中GRP78、CHOP、Calpain2 mRNA水平变化含量 采用大鼠的心肌组织，按照文献[6]方法进行RNA提取、纯化、RT反应和qPCR反应并计算分析实验结果。

1.6 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况 参考文献[7]将收集好的心肌组织石蜡包埋、切片、苏木素染核，将切面放入Tris-HCl（含3%牛血清白蛋白和20%牛血清）中15～25℃浸泡，后经磷酸缓冲盐溶液（PBS）浸泡润洗2次，晾干，在切片上滴加50 μL TUNEL 反应混合液，37℃孵育 1．5 h，PBS洗 3遍，稍微放干在倒置显微镜下观察组织细胞凋亡情况，计算凋亡率，随机选取5个非重叠400倍镜视野，计录凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数，心肌细胞凋亡率=凋亡心肌细胞数/心肌细胞总数×100%。

1.7 蛋白免疫印记实验分析各组大鼠相对蛋白表达量 大鼠的心肌组织参考文献[8]的方法进行蛋白提取、SDS-PAGE电泳、转膜，及封闭。按需求加入 Caspase-12 抗体（1∶1 000）、CHOP 抗体（1∶2 000）、GRP78 抗体 （1∶2 000）、Calpain2 抗体 （1∶1 000）、Capastatin抗体（1∶1 000）及 GAPDH（内参）抗体 4℃温育过夜。次日，TBST洗膜3次，再加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温杂交1 h，PVDF膜以化学发光试剂盒进行显色，用Syngene Imaging System进行成像，用Image J对蛋白印迹条带进行处理和分析。

1.8 统计学方法 采用Prism 7．0软件对实验结果进行统计学分析，数据以均数±标准差s）表示。多样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较，方差齐时采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett’s T3 法，P＜0．05 为具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组动物TUNEL染色结果 心肌TUNEL染色后对照组和实验组均发现了不同程度的深棕色凋亡细胞，见图1。与空白组相比，对照组细胞凋亡明显，凋亡率（27．8±3．1）显著增加（P＜0．01）；与对照组相比，实验组细胞凋亡（18．7±2．2）显著减少（P＜0．01）。

图1 各组大鼠心肌TUNEL染色（×200）Fig.1 Myocardial TUNEL staining of rats in each group（×200）

2.2 各组动物Caspase-12、Caspase-3蛋白表达变化 与空白组相比，Caspase-12和Caspase-3蛋白均明显上调（P＜0．01），而与对照组相比，实验组上述蛋白均有不同程度下调（P＜0．01）。见图2A和表1。

图2 各组大鼠心肌Caspase-12、Caspase-3、GRP78和CHOP相对蛋白表达水平Fig.2 Elative protein expression levels of Caspase-12,Caspase-3,GRP78 and CHOP in myocardium of rats in each group

表1 各组大鼠心肌Cleaved caspase-12、Cleaved caspase-3、GRP78 和 CHOP 相对蛋白表达水平（Tab.1 Relative protein expression levels of Cleavedcaspase-12,leaved-caspase-3,GRP78 and CHOP in myocardium of rats in each group（%

表1 各组大鼠心肌Cleaved caspase-12、Cleaved caspase-3、GRP78 和 CHOP 相对蛋白表达水平（Tab.1 Relative protein expression levels of Cleavedcaspase-12,leaved-caspase-3,GRP78 and CHOP in myocardium of rats in each group（%

注：与空白组比较，*P＜0．01；与对照组比较，#P＜0．01。

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2.3 各组动物GRP78、CHOP、Calpain2 mRNA水平变化 与空白组相比，对照组GRP78、CHOP、Calpain2 mRNA 表达明显升高（P＜0．01），而与对照组相比，实验组动物GRP78、CHOP、Calpain2 mRNA表达下降（P＜0．05）。见图 3。

图3 各组大鼠心肌GRP78、CHOP和calpain2 mRNA表达水平Fig.3 Relative mRNA expression levels of GRP78,CHOP and Calpain2 in myocardium of rats in each group

2.4 各组动物GRP78、CHOP蛋白表达变化 与空白组相比，对照组GRP78和CHOP蛋白均明显上调（P＜0．01）；与对照组相比，实验组上述蛋白均有不同程度下调（P＜0．01）。见图 2B 和表 2。

表2 各组大鼠心肌Calpain2、Calpastatin和p-ERK相对蛋白表达水平（Tab.2 Relative protein expression levels of Calpain2,Calpastatin and p-ERK in myocardium of rats in each group（%

表2 各组大鼠心肌Calpain2、Calpastatin和p-ERK相对蛋白表达水平（Tab.2 Relative protein expression levels of Calpain2,Calpastatin and p-ERK in myocardium of rats in each group（%

注：与空白组比较，*P＜0．01；与对照组比较，#P＜0．01。

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2.5 各组动物p-ERK、Calpain2和Capastatin蛋白表达变化 与空白组相比，对照组p-ERK和Calpain2 蛋白均明显上调（P＜0．01），Capastatin 蛋白表达下降；而与对照组相比，实验组p-ERK和Calpain2蛋白表达下调，Capastatin蛋白表达升高（P＜0．01），见图 4 和表 2。

3 讨论

内质网应激（ERS）是凋亡的主要途径之一，短期的ERS会导致抗凋亡的GRP78表达上调，而长期ERS会促进CAAT/CHOP以及胱天蛋白酶12剪切体（Cleaved-caspase-12）表达升高[9]。本研究发现，CHD模型大鼠心肌Cleaved caspase-12、GRP78和CHOP表达升高，同时凋亡的执行者Caspase-3剪切体（Cleaved caspase-3）增加。提示，模型动物心肌出现内质网应激凋亡。研究表明，Calpain2为Caspase-12的上游信号分子[10]。本实验发现模型大鼠Calpain2表达上调，而Calpastatin表达下调，提示Calpain2的表达和活性增强。近期研究发现，砷诱导的巨噬细胞凋亡伴随着Calpain2的激活和ERK的磷酸化增强[11]。本研究发现模型动物p-ERK升高，Chen等[12]报道ERK为Calpain的上游信号靶点，p-ERK表达升高能提高Calpain活性，这些提示CHD大鼠心肌细胞可能通过ERK-Calpain2信号通路促进内质网应激凋亡。

图4 各组大鼠心肌Calpain2、Calpastatin和p-ERK相对蛋白表达水平Fig.4 Relative protein expression levels of Calpain2,Calpastatin and p-ERK in myocardium of rats in each group

本研究实验组以BBR灌胃治疗后发现，模型动物心肌ERS标志物Cleaved caspase-12、GRP78和CHOP表达下降，凋亡执行蛋白Cleaved caspase-3表达减弱。提示BBR能抑制CHD大鼠心肌发生内质网应激凋亡，而进一步实验发现心肌Calpain2表达下调，Calpastatin上调，p-ERK蛋白下调，提示ERK-Calpain2信号转导减弱。

综上所述，BBR能抑制CHD大鼠心肌细胞发生内质网应激凋亡，该作用可能与抑制ERKCalpain2信号通路有关。