交泰丸含药血清对豚鼠心室肌细胞ICa-L的影响*

邢作英，王永霞，朱明军，陈召起，宋欢欢，高 原，胡宇才，陈 鹏，郑 佳

（1．河南中医药大学第一附属医院心脏中心，郑州 450000；2．河南省人民医院宣传处，郑州 450000）

交泰丸首见于明代《韩氏医通》，清代王士雄《四科简效方》，始出交泰丸方名，标明黄连和肉桂用量10∶1，用药以黄连为主。目前在临床主要应用于病机为心火亢盛，心肾不交之心悸。心律失常多归属于中医的“心悸”、“怔忡”等范畴，是心脏电活动失常的表现。早期的临床观察发现交泰丸对室性早搏及多种原因引起的快速性心律失常有效。司晓晨等[1]研究发现：黄连的提取物黄连素可以保护心肌细胞膜，阻断Ca2+超负荷所触发的迟后除极，从而消除触发活动所致的心律失常。钙通道是心肌细胞维持动作电位平台期的主要电流，同时为其他离子流活动和心肌细胞的不应期提供适合的电位条件[2]。但是交泰丸能否通过调控L-型钙离子电流调节心肌电活动，从而影响心率发挥抗心律失常作用少有报导。因此，本实验利用血清药理学及膜片钳实验技术，从离子通道水平研究交泰丸对单个豚鼠心室肌细胞钙离子电流及其动力学参数的影响，探讨其治疗心律失常的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性SD大鼠，8～12周，250～350 g，SPF级，由北京维通利华实验动物公司提供，合格证号：SCXK（京）2010-0001；成年豚鼠，10～12 周，雌雄兼用，250～350 g，清洁级，由北京金牧阳实验动物公司提供，合格证号：SCXK（京）2011-0004，动物伦理审批号：YFYDW2013008。

1.2 仪器 倒置显微镜（日本Olympus IX71），放大器（Heka，EPC-10），三维操纵仪（Sutter），软件（PatchMaster，德国 Heka公司），GraphPad Prism 5，Igor，玻璃微电极及其他手术、细胞培养器械。

1.3 溶液和试剂 根据参考文献，溶液和试剂如下：Buffer A缓冲液，Buffe B缓冲液，25℃下调pH 值至 7．3～7．4。心肌细胞培养液，钙通道细胞外液25 ℃下 pH 值调至 7．2[3-4]。

1.4 血清制备和分组 中药复方具有其独特的物质基础，与单味药及其简单加和在化学成分上可能有区别[5]，所以按照《四科简效方》交泰丸原方比例黄连：肉桂（10∶1）配伍，取黄连（江苏江阴天江药业有限公司，批号为20130725）100 g，肉桂（江苏江阴天江药业有限公司，批号为20130512）10 g合并煎煮为交泰丸组。另取黄连100 g，肉桂10 g分别煎煮制备黄连组和肉桂组，黄连煎液和肉桂煎液以1∶1比例混合为黄连加肉桂组，各药量分别为成人的5倍剂量，以1 mL/100 g（体质量）的剂量灌胃给予大鼠，每日2次，空白组给予等容积生理盐水。连续给药3 d，末次给药1 h后戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉动物，采血离心收集血清。分别制得空白、黄连、肉桂、黄连加肉桂和交泰丸含药血清，在制备的心肌细胞液中分别加入10%和15%浓度相应血清放于37℃，5%CO2的孵育箱中孵育24 h后，选取完整、立体、横纹清晰的细胞进行膜片钳实验。

1.5 豚鼠心室肌细胞分离 改装Langendorff灌流装置[6-8]，出口温度调为37℃，出口滴速调为3～4 mL/min。乙醇50 mL，去离子水400 mL，Buffer A 50 mL，Buffer B 100 mL，其中50 mL盛放于10 cm小皿中置于4℃冰箱中备用。KB液150 mL，酶液50 mL均通以100%氧气持续饱和30 min以上。Buffer B（约20 mL）封口单向灌流冲管，腹腔注射2%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉豚鼠，迅速游离并取出心脏，放入4℃Buffer B中，游离主动脉，逆行插管连于灌流装置上，行Langendorff灌流。先用Buffer B逆向灌流心脏1～3 min，后改为Buffer A灌流1～3 min，最后以酶液灌流，灌流器内进液约10 mL后酶液循环灌流消化心脏。约20 min后取下心脏用眼科剪将心室肌组织剪成尽量小的组织块盛于KB液中，用吸管轻轻吹打，使细胞分离，获得单个心室肌细胞。用200目的细滤网过滤含有心肌细胞的KB液，过滤后的细胞液用小烧杯定容至30 mL备用。

1.6 全细胞膜片钳记录 实验在室温（20～25℃）下进行[9-10]，细胞孵育24 h后取出，加入钙通道细胞外液，同时配合使用钙通道电极内液。显微镜下选取外形完整，形状规则，横纹清晰的细胞进行实验。拉制玻璃微电极充灌好电极内液吸引封接心肌细胞，形成高阻封接（Giga seal），注射器负压吸引破膜，进行电容补偿。补偿完成后给予相应的电信号刺激，进行信号采集。激活曲线给予-70 mV钳位电压，从-60 mV开始阶跃刺激，以10 mV为间隔阶跃至60 mV，每次阶跃电压持续250 ms；失活曲线给予-70 mV钳位电压，从-60 mV开始阶跃刺激，以10 mV为间隔阶跃至40 mV，每次阶跃电压持续1 000 ms，每次阶跃电压后给以250 ms的10 mV钳位电压；失活后恢复曲线给予-70 mV钳位电压，给以 10mV 电压，持续 250ms，后间隔（1、2、4、8、16……2 048 ms）再次给以持续250 ms的10 mV电压，记录ICa-L失活后恢复曲线。信号经四阶贝塞尔的低通滤波器，截止频率为1 kHz，采样频率为10 kHz。记录ICa-L激活电流、失活电流和恢复电流，分析得到激活、失活和失活后恢复时间常数。

1.7 统计学方法 数据统计使用SPSS 20．0软件，数据以均数±标准差s）表示，给药后各组间进行比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，P＜0．05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组电流密度变化 10%浓度黄连组、肉桂组、黄连加肉桂组和交泰丸组各组ICa-L峰值电流密度（pA/pF）与空白组比较抑制率分别为：50．3%（P＜0．05）；25．5%（P＞0．05）；15．2%（P＞0．05）；57．5%（P＜0．05）。15%浓度各组与空白组比较抑制率分别为：27．5%（P＞0．05）；4．9%（P＞0．05）；47．9%（P＜0．05）；54．5%（P＜0．05）。其中与空白组比较抑制率最大的是10%浓度交泰丸组，抑制率为57．5%。见表1、图1。

表1 各组ICa-L电流密度比较s，pA/pF）Tab.1 Comparison of ICa-L current density of each groups,pA/pF)

表1 各组ICa-L电流密度比较s，pA/pF）Tab.1 Comparison of ICa-L current density of each groups,pA/pF)

注：与空白组比较，*P＜0．05。

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图1 各组ICa-L抑制率Fig.1 Inhibition rates ICa-L of each group

2.2 激活和失活时间常数变化 10%和15%浓度各组的激活时间常数和失活时间常数分别如表2所示。与空白组比较：10%浓度肉桂组的快失活时间常数变化率最大（P＜0．05）；15%浓度组激活时间常数肉桂组和交泰丸组与空白组比较差异有统计学意义（P＜0．05），黄连组和黄连加肉桂组与肉桂组比较差异有统计学意义；15%浓度组快失活时间常数肉桂组和交泰丸组与空白组比较差异有统计学意义（P＜0．05），黄连组与肉桂组比较差异有统计学意义；15%浓度组慢失活时间常数各组与空白组比较差异有统计学意义（P＜0．05）；药物使钙离子通道激活和失活减慢，激活和失活时间延长。各组恢复时间常数分别如表2所示，其中与空白组比较，15%浓度各组失活后恢复时间常数变化差异有统计学意义（P＜0．05）；药物使钙离子通道失活后恢复时间延长，通道恢复减慢。

表2 各组豚鼠心室肌细胞ICa-L激活、失活时间常数和失活后恢复时间常数比较

表2 各组豚鼠心室肌细胞ICa-L激活、失活时间常数和失活后恢复时间常数比较

注：与空白组比较，*P＜0．05；与黄连组比较，#P＜0．05；与肉桂组比较，△P＜0．05。

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3 讨论

中医药以其悠久的历史，确切的疗效，在临床应用治疗心律失常方面有良好的疗效[11-14]。复方与单味药及其简单加和在化学成分上有区别，在为数众多的化学成分中，究竟那些是有效成分，哪些是无效成分，哪些是起主要作用的成分等尚未可知。鉴于此，本实验分组中不仅观察了黄连组、肉桂组和交泰丸组的作用差异，也观察了两药机械加和后的黄连加肉桂组的药理作用。实验结果显示：黄连加肉桂组和交泰丸组对各指标的影响差异并不十分显著，可见两种煎药方式对药效影响不明显。

预实验确定血清药浓度为10%和15%，这两个浓度可以较好地检测药物对钙通道的药效作用，并且呈现出一定的剂量依赖性。但是，在记录钙通道电流的过程中，各组药物对钙电流的抑制率并不全部呈现出剂量依赖性，10%浓度的交泰丸组抑制率最大为57．5%，可能是实验过程中产生了细胞毒性的原因。同时结果显示，在药物对钙通道的作用中，复方交泰丸的药效并非总是最好的，肉桂含药血清使钙通道的激活和失活时间常数及失活后恢复时间常数变化最显著，说明中药复方及其拆方的药效存在差异。

实验结果显示：交泰丸各组分药物抑制钙离子电流，延长钙通道的激活和失活时间常数，使失活后恢复时间常数均不同程度延长，药物对钙通道动力学参数的影响可能导致了钙电流减小。钙离子通道阻滞剂（CCB）[15-16]主要集中应用于快速性心律失常中。CCB通过降低自律细胞动作电位4相坡度而降低自律性[17]，减少0期除极速度及幅度而抑制传导。对于房扑房颤患者能够减慢心室率，促进转复为窦性心律。交泰丸各组分含药血清可以抑制钙离子电流，其作用与钙离子阻滞剂作用机制相同，提示交泰丸可能在防治心律失常的过程中通过抑制钙离子通道电流，降低了细胞自律性，抑制传导，延长细胞动作电位以延长心肌有效不应期，促进窦性心律的转复，从而发挥抗心律失常的作用，这可能是交泰丸具有抗心律失常作用的机制。本实验研究交泰丸对心肌细胞膜电位的影响，实验中排除了药物本身离子成份的影响，精确反应药物非离子因素的药理作用，以探讨其抗心律失常的药理机制。但是交泰丸对钙通道相关蛋白影响和对整体动物心律失常的影响仍需要进一步研究。