基于16SrRNA基因测序技术研究低聚异麦芽糖对奶牛瘤胃细菌菌群的影响

郭 成，郭婷婷，胡丹丹，张力莉，徐晓锋

（宁夏大学农学院，银川 750021）

低聚异麦芽糖是α-1，6-糖苷键相连的低聚糖类，是功能性寡糖的一种，对肠道微生物菌群具有调节作用[1-2]。Zhang等[3]在肉雏鸡的基础日粮添加0.3%、0.6%、0.9%和 1.2%的异麦芽糖，结果表明，雏鸡的生长性能得到提高，而且在补充异麦芽糖后，十二指肠消化道中异丁酸和乙酸的含量降低。S.N.Thitaram等[4]给鸡添加低聚异麦芽糖会显著增加鸡盲肠双歧杆菌数量。张建斌等[5]研究报道日粮添加0.3%低聚异麦芽糖在一定程度上能够替代抗生素，显著增加鸡的盲肠和回肠双歧杆菌和乳酸杆菌的数量。A.Ketabi等[6]发现低聚异麦芽糖可以刺激大鼠肠道中乳酸杆菌的生长。王少光等[7]研究表明低聚异麦芽糖也能促进小鼠肠道双歧杆菌的增值，显著降低大肠杆菌数量，对肠道乙酸、丁酸等挥发酸模式存在显著影响。陈国旺等[8]研究发现谷氨酰胺与低聚异麦芽糖互作会显著增加猪肠道双歧杆菌和乳酸杆菌的增值。大量研究表明低聚异麦芽糖能够促进单胃动物和鸡肠道有益菌群的增值，改变肠道挥发酸模式。

近年来异麦芽糖在反刍动物上的研究也逐步开展。王新峰等[9]在断奶羔羊上研究表明，低聚异麦芽糖会降低瘤胃产琥珀酸丝状杆菌数量。祁茹等[10]研究发现低聚异麦芽糖也能显著降低成年反刍动物奶山羊的肠道大肠杆菌数量。反刍动物与单胃动物的最大不同在于瘤胃系统，瘤胃存在纤毛虫、真菌以及大量细菌，低聚异麦芽糖对单胃动物肠道菌群的作用已经很清楚，对瘤胃菌群的作用尚不清晰。我们前期研究发现在奶牛基础日粮中添加60 g低聚异麦芽糖可以改变奶牛瘤胃中挥发酸的比例，提高瘤胃中丁酸的发酵比例[11]。这对于提高牛奶的乳脂合成具有潜在意义，但具体机制还不清楚。本研究拟从瘤胃微生物区系去探讨低聚异麦芽糖对奶牛瘤胃发酵的影响。

1 材料和方法

1.1 试验动物与饲养管理

选择4头泌乳中国荷斯坦奶牛作为试验动物，分为对照组和试验组。奶牛日产奶量30 kg左右、体重为550 kg左右。根据NRC（2001）奶牛饲养标准配制日粮，精粗比为 40∶60（DM 基础，m:m），日粮组成和营养成分见表1。采用TMR饲喂方式，全天自由饮水。

表1 奶牛试验日粮组成及营养成分Table 1 Dietary composition and nutritional composition of dairy cows%

1.2 试验设计

将4头试验牛随机分为2组，每组两头牛，一组为对照组（CK），一组为实验组（IOT）。对照组饲喂基础饲粮，试验组饲喂基础饲粮并同时添加60 g/头低聚异麦芽糖（纯度为90%，郑州文翔化工产品有限公司），通过口腔灌注添加，在早晚饲喂前分两次灌注。采用两阶段试验设计，第一阶试验结束，经过恢复期后，再将试验组和对照组交叉，由之前对照组变为试验组，每阶段对照组和试验组重复数为2，合并后每组n=4。试验每阶段21 d，其中预饲期7 d，正式期14 d。

1.3 样品的采集与处理

使用负压吸取装置（自行设计），通过奶牛口腔釆集瘤胃液。采集时间分别为饲喂前（0 h）及饲喂后2、4、6 h取样，每次取瘤胃液50 mL。为获得具有代表性的样品，每天4个时间点所取的瘤胃内容物样品经混匀后各取5 mL，充分混合，转入冻存管放液氮临时保存，转移到试验室放-80℃冰箱保存。

1.4 DNA样品提取、扩增

1.4.1 DNA 提取

取2 mL瘤胃液提取瘤胃微生物DNA，采用试剂盒法，试剂盒采购于南京建成生物研究所。

1.4.2 PCR 扩增

PCR扩增前用琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的纯度和浓度，于离心管中取适量的样品进行稀释。将稀释后的基因组DNA作为模板。瘤胃液DNA扩增目的片段为V3+V4区，大概长度468 bp，引物序列为：V3+V4：341F-806R[12]。

341F：CCTAYGGGRBGCASCAG；

806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT

1.5 PCR产物的混样和纯化

PCR产物使用胶浓度为2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测；依照PCR产物浓度的检测结果进行等浓度混样，充分混匀后使用胶浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用南京建成生物研究所提供的回收试剂盒回收产物。

1.6 Miseq测序及数据

将样品送至广州基迪奥生物科技有限公司进行Miseq测序，其测序采用Miseq 2500 PE 250平台，数据由平均值和标准误表示，以P＜0.05作为差异显著性判定标准。

2 结果与分析

2.1 总DNA质检结果

对瘤胃液样品的总DNA进行质量检测，浓度及纯度均符合IlluminaMiseq平台测序要求。

2.2 奶牛瘤胃细菌菌群序列及多样性分析

2.2.1 瘤胃细菌菌群 OTUs比较

经IlluminaMiseq测序结束后，除去低质量序列，通过序列拼接，应用Mothur根据97%的序列相似度，对序列进行OTU聚类，对样品进行OTU的统计，剔除稀有OTU后对照组CK样品获得2734个，试验组IOT样品获得2 593个。样品间差异不显著（P＞0.05），两个样品共享OTU为1 434个（见图1）。

图1 低聚麦芽糖对瘤胃细菌菌群基因OTU分布的影响Figure 1 Effect of isomaltooligosaccharides on the distribution of ruminal bacterial flora gene OTU

2.2.2 瘤胃细菌alpha多样性分析

基于OTU的结果，计算样品的alpha多样性，如表2所示。对照组和试验组样品的alpha多样性结果见表2。由表2可知饲喂低聚异麦芽糖组奶牛瘤胃细菌菌群的chao值和ace值与对照组比较差异不显著，说明饲喂低聚异麦芽糖使瘤胃细菌多样性无显著影响。与对照组比较瘤胃细菌菌群的Shannon指数比较，说明饲喂低聚异麦芽糖组奶牛瘤胃菌群种类分布均匀度有升高的趋势（P＜0.1）。本试验的瘤胃液样品的Shannon曲线见图2。如图所示，当测序深度达到5 000 reads时，曲线趋于平缓，各样品达到饱和状态，表明本试验的测序深度可以覆盖各样品中大多数微生物。

表2 样品在0.03距离下的Alpha丰富程度表Table 2 Alpha richness table of samples at 0.03 distance

图2 低聚麦芽糖对瘤胃细菌菌群基因Shannon指数的影响Figure 2 Effect of isomaltooligosaccharides on Shannon of ruminal bacterial flora gene

2.2.3 瘤胃细菌的beta多样性分析

Beta diversity值越接近0，表示这两个样品在物种多样性方面存在的差异越小。试验组和对照组的beta多样性分析结果见图3。如图所示，从图形上观察，试验组和对照组相比，（即IOT-1和CK-3、IOT-2和 CK-4、IOT-3 和 CK-1、IOT-4 和 CK-2），发现试验组较对照组相比颜色有变化，且beta diversity值均超过0.02，说明奶牛日粮中添加异麦芽糖可以改变瘤胃细菌菌群的多样性。

2.3 奶牛瘤胃细菌菌群结构分析

2.3.1 瘤胃细菌在门水平上的结构分析

从门水平上分析，图4可以直观反映出试验组和对照组采集的样品中所含的主要细菌门主要为Bacteroidetes（拟杆菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）和Proteobacteria（变形细菌门），占到了总细菌门比例的95%以上。

图4 不同处理组门水平上的菌群结构Figure 4 Microbial structure at phylum level in different treatment groups

2.3.2 瘤胃细菌在属水平上的结构分析

进一步研究到属水平，分析瘤胃种群结构。图5为属水平上瘤胃细菌的种群组成。由图5也可知，Prevotella（普雷沃式菌属）、Butyrivibrio（丁酸弧菌属）、Succiniclasticum（解琥珀酸菌属）和Ruminococcus（瘤胃球菌属）这4种细菌属占总菌属的60%左右。

2.3.3 低聚异麦芽糖对瘤胃菌群结构的影响

以门水平和属水平为代表，分析瘤胃菌群微生物变化。两组试验牛瘤胃液中总细菌共涉及25个门，225个属。本表共列出7个门，24个属。由表3可知，在门水平上，在日粮中添加低聚异麦芽糖后，奶牛瘤胃Verrucomicrobia（疣微菌门）丰度显著增加（P＜0.05），其他菌门丰度无明显变化。在属水平上，Prevotella（普雷沃式菌属）、NA（未注释菌属）、S24-7_NA、Ruminococcaceae_NA（未注释瘤胃球菌属）、Ruminococcus（瘤胃球菌属）、Prevotellaceae_NA（未注释普雷沃式菌属）、Lachnospiraceae_NA（未注释毛螺旋菌属）、Succiniclasticum（解琥珀酸菌属）、Succinivibrionaceae_NA（未注释琥珀酸弧菌属）、Butyrivibrio（丁酸弧菌属）、Succiniclasticum（解琥珀酸菌属）和Treponema（密螺旋体属)和Coprococcus（粪球菌属）共11个菌属丰度占整体的91%以上。由表3可知，饲喂低聚异麦芽糖后，奶牛瘤胃液Comamonadaceae_NA（未注释丛毛单胞菌属）丰度极显著提高（P＜0.01），WCHB1-25_NA 丰度极显著增加（P＜0.01），Ruminobacte（瘤胃杆菌属）丰度显著增加（P＜0.05），盐细菌属 Salinibacterium 丰度显著增加（P＜0.05），Lactobacillus（乳酸杆菌属）丰度显著降低（P＜0.05）。Acidaminococcus（氨基酸球菌属）、Aerom-icrobium（气微菌属）、Actinotalea、Adlercreutzia菌属丰度有增加趋势（0.05＜P＜0.1），TMEG_NA 菌属丰度有降低的趋势（0.05＜P＜0.1）。

图5 不同处理组属水平上的菌群结构Figure 5 Microbial structure at genus level in different treatment groups

3 讨论

反刍动物瘤胃中的微生物将纤维物质转化为营养成分和能源物质供机体吸收利用。由细菌，真菌，原虫以及古细菌等组成的瘤胃微生物群体，成为了宿主反刍动物必不可少的共生关系的复杂网络。反刍动物瘤胃细菌中的，优势菌群为拟杆菌门，厚壁菌门，纤维杆菌和变形菌门[13]。本试验中，在添加低聚异麦芽糖后，奶牛瘤胃细菌多样性无显著性差异。祁茹等[14]报道的低聚异麦芽糖对瘤胃液细菌总数没有产生显著性影响。闵力[15]通过PCR-DGGE技术研究功能性寡糖组合对锦江黄牛瘤胃固相细菌的多样性发现，日粮中添加功能性寡糖增加了栖瘤胃普雷沃氏菌属，提高瘤胃中微生物的多样性。王新峰等[16]研究发现，在羔羊饲粮中添加低聚异麦芽糖及混合低聚糖对瘤胃细菌的多样性无显著影响，添加低聚异麦芽糖对反刍动物瘤胃细菌菌群多样性影响的报道结果并不一致，低聚异麦芽糖对瘤胃菌群多样性影响有可能与动物种类，发育阶段以及寡糖添加量有关。

粗饲料是反刍动物最主要的饲料来源，细菌在分解利用纤维素过程中起主要作用，其中纤维素降解菌起重要作用。纤维降解菌通过酶的催化使纤维素和半纤维素分解为瘤胃能够吸收的小分子物质，纤维物质的降解需要在各种酶的协同作用下完成，酶活性的改变会影响纤维物质的降解[17-20]。林英庭等[21]研究表明，在山羊的日粮中添加1%的低聚异麦芽糖，可以显著提高纤维降解酶活性，提高纤维降解率。本试验中，添加低聚异麦芽糖后，发现添加低聚异麦芽糖并未显著改变瘤胃球菌、纤维杆菌属等主要瘤胃纤维降解菌的丰度。添加外源寡糖可以提高常用饲料的干物质瘤胃消失率，祁茹[22]在山羊日粮中添加低聚异麦芽糖，发现玉米，豆粕，羊草，苜蓿青干草的瘤胃消失率显著提高。反刍动物精饲料多为淀粉构成，在降解淀粉中起着突出作用的瘤胃细菌包括普雷沃氏菌属，梭菌属，牛链球菌属，产琥珀酸纤维杆菌属，嗜淀粉瘤胃杆菌和反刍动物月形单胞菌等[23]。本研究表明，日粮添加低聚异麦芽糖对奶牛瘤胃液瘤胃杆菌属丰度提高显著，可促进瘤胃内淀粉的分解代谢。

高精日粮会导致瘤胃酸中毒或亚急性酸中毒，当瘤胃处于酸中毒或者亚急性瘤胃酸中毒时，瘤胃发酵模式和脂肪酸乳腺的分泌会发生改变[24-25]。研究表明，当奶牛发生亚急性酸中毒时可引起乳脂下降[26]。乳酸产生菌与乳酸利用菌之间的菌群平衡紊乱，使瘤胃内乳酸积累，是诱发瘤胃酸中毒的主要原因[27-28]。瘤胃内乳酸产生菌主要有溶纤维丁酸弧菌、牛链球菌、乳酸杆菌等[29]。本试验中，日粮添加低聚异麦芽糖，奶牛瘤胃乳酸生成菌乳酸杆菌丰度显著降低，这对于调控瘤胃pH有一定意义。

表3 低聚异麦芽糖对瘤胃细菌菌群结构的影响Table 3 Effect of isomaltooligosaccharides on the structure of bacterial flora in rumen%

4 结论

本试验利用16SrRNA基因高通量测序技术分析奶牛瘤胃细菌菌群在添加低聚异麦芽糖后的变化，发现在日粮中添加低聚异麦芽糖后，奶牛瘤胃细菌菌群多样性无显著差异，并未显著改变瘤胃纤维菌群等主要瘤胃纤维降解菌的丰度，降解淀粉瘤胃杆菌属显著提高，乳酸生成菌乳酸杆菌丰度显著降低。