旧院黑鸡绿壳蛋群体的筛选及其与东乡绿壳蛋鸡纯系杂交后代的生产性能杂种优势分析

刘 嘉，李富贵，覃 飞，苗小猛，于雪珂，杨福领，张 羽，朱 庆，王 彦，尹华东，李地艳，舒 刚，赵小玲*

（1.四川农业大学动物科技学院，成都 611130；2.四川农业大学动物医学院，成都 611130）

绿壳鸡蛋不仅壳色特别，而且具有低胆固醇、低脂肪等特性，富含硒、碘、铁和锌等多种微量元素[1]，符合市场需求且前景广阔。目前，成熟的绿壳蛋鸡配套系较少，故需在绿壳蛋鸡的品种选育上做进一步的研发工作。

绿壳性状由1号常染色体显性绿壳基因（Oocyan，O）控制，与胆色素的合成或分泌有关，SLC01B3基因（Solute carrier organic anion transporter family member 1B3，SLC01B3）能够帮助胆盐类物质跨膜运输至卵壳腺，卵壳腺上皮细胞将胆绿素分泌至蛋壳中，使得蛋壳最终呈现绿色。研究表明，由于鸡3号染色体上 EAV-HP（Endogenous avain retrovirus-HP）的长末端重复序列转插入到了鸡1号染色体SLCO1B3基因和SLCO1C1基因之间，促使SLC01B3基因过量表达，从而产生绿壳蛋[2]。鸡绿壳蛋性状具有显性遗传的特点，通过表型选择难以彻底剔除隐性等位基因，因而在短期内难以将绿壳蛋鸡的性状固定，而采用分子标记技术进行基因型的筛选，更为精确、省时。

四川旧院黑鸡是四川省万源市特有的地方品种，其最显著的特征为乌皮、黑羽、五豆冠、黑胫，在其自然群体中，约有10%～20%的个体产绿壳蛋。本试验将绿壳蛋分子标记应用于旧院黑鸡公鸡绿壳蛋性状阳性纯合子鉴定并将其与绿壳蛋鸡（LK系）杂交，以期获得兼具双亲优点的杂交组合。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验采用四川农业大学家禽育种场饲养的旧院黑鸡JY系（第二世代）公鸡60只、绿壳蛋鸡LK系（第二世代）母鸡各300只。JY系公鸡用于绿壳基因检测，选出基因型为阳性纯合的JY系公鸡与LK系母鸡进行杂交，形成JL杂交组合。将JY系（第三世代）、LK系（第三世代）与JL杂交组合母鸡于相同条件下饲养，自由饮水及采食，基础饲粮为玉米-豆粕型，参考《鸡饲养标准》（NY/T 33-2004）并结合生产实际进行配制，基础饲粮组成和营养水平见表1。0～6周龄采用三层重叠式育雏笼饲养，在育成和产蛋阶段（7～43周龄）采用两层阶梯单笼饲养。育雏期光照强度为5 lx，光照时间由第1天的24 h逐渐降为6周龄时的8 h；育成期及产蛋期光照强度为10 lx，逐渐提升光照时间到16 h，并持续整个产蛋期。

1.2 试验方法

1.2.1 JY 系公鸡绿壳基因检测

选取60只JY系公鸡，翅下采血，用酚-氯仿法[3]提取血液DNA。并使用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测 DNA 浓度，其 OD260/OD280值为 1.8～1.9的为合格样品，于-20℃下进行保存。

应用四川农业大学动物科技学院家禽育种课题组所公布的引物及PCR扩增程序[（《用于鉴别绿壳蛋鸡基因型的引物组合物及其应用》，发明专利申请号：CN 2014102387004）]，对血样DNA进行扩增。取扩增产物3 μL于1.5%的琼脂糖凝胶上在220 V下进行电泳，根据与DNA Marker 2000跑出的标准条带进行对比，根据条带数目及大小判断基因型。其中LS/LS为纯合子绿壳蛋基因型，只出现209 bp的条带；LS/CC为杂合子绿壳蛋基因型，出现209 bp和312 bp的条带；CC/CC为非绿壳蛋基因型，只出现312 bp的条带。

1.2.2 杂交模式

将筛选出的JY系绿壳基因显性纯合型个体作为父本，LK系（第二世代）作为母本，混合精液人工授精，收集种蛋。并纯繁得到第三世代JY系和LK系种蛋，相同条件下进行种蛋孵化。

1.2.3 生产性能测定

①孵化性能：记录入孵蛋的总数、种蛋受精率、孵化率以及健雏率等。

②早期体重测定：分别在 2、4、6、8、10 周龄末清晨进行称重（停食12 h），3个群体每次各随机抽测20只。

③产蛋性能指标：记录3个群体每个个体的开产日龄、开产体重、开产蛋重，统计开产到300日龄每天的绿壳蛋率并统计300日龄的产蛋量（饲养日产蛋数）、蛋重及个体重等。

④30周龄蛋品质：从30周龄（产蛋高峰期）开始连续收集JY系、LK系及杂交组合3 d的鸡蛋，每天每组随机抽取10个进行蛋品质的测定。蛋形指数、蛋壳厚度用游标卡尺测定，蛋壳颜色用光电反射式色度仪测定，蛋壳强度用蛋壳强度仪测定，蛋黄颜色、蛋白高度、哈氏单位用 EMT-5200多功能蛋品质分析仪测定，蛋重和蛋黄重用电子秤测定。

表1 不同阶段基础饲粮组成及营养指标（风干基础）Table 1 Composition of basal diets and feed nutrition index at different stages （air-dry basis）

1.3 数据处理

原始数据用Microsoft Excel 2010进行整理后，再用JMP Pro v.10软件中的一般线性模型（GLM）进行方差分析（影响因素为群体），并用Tukey法对方差分析显著的结果进行群体间多重比较，显著水平为0.05，试验结果以“平均值±标准误”表示，并计算杂种优势率（H）。杂种优势率计算公式如下：

其中，H表示杂种优势率，P1、P2分别代表父本纯种均值、母本纯种均值，F1代表杂种均值。

2 结果与分析

2.1 JY系公鸡绿壳蛋基因显性纯合子筛选结果

本试验从60只JY系公鸡血样中共检测到6只显性纯合绿壳基因型个体（LS/LS）、10只杂合绿壳基因型个体（LS/CC）以及44只隐性纯合基因型个体（CC/CC）。并将6只显性纯合绿壳基因型个体用于接下来的杂交试验。3种带型分别如图1所示：

图1 不同基因型筛选结果Figure 1 Screening results of different genotypes

2.2 孵化性能及早期体重

从表2可知，JL杂交组合的受精率分别比JY系和LK系高2.53%、5.89%，并表现出明显的正向杂种优势。而JL的孵化率比LK系低2.94%，3个群体的健雏率均较高。

表2 3个群体主要孵化性能指标及杂交组合杂种优势率Table 2 The hatching performance index of three populations and heterosis percentage

由表3可知，在2周龄和6周龄时，JL杂交组合和 JY 系的体重均显著高于 LK 系（P＜0.05），其中，JY的2周龄体重和6周龄体重分别比LK高出19.41%和 22.03%，JL 则分别比 LK 高出 14.65%、25.37%。JL杂交组合早期体重均表现出明显的正向杂种优势，且在第6周时优势率最高（H=12.93%）。

表3 3个群体早期体重及杂交组合杂种优势率Table 3 The early body weight of three populations and heterosis percentage

2.3 JY系、LK系及杂交组合母鸡外貌特征

JY系母鸡为乌色豆冠、乌喙、蓝耳、黑胫，体覆乌羽且富有光泽；LK系母鸡为红色单冠、黑灰色喙、粉红耳、灰胫、黑羽，色泽较JY系暗；JL杂交组合母鸡为乌色单冠、乌喙、蓝耳、黑胫、乌羽（见图2）。

图2 JY系（A）、LK系（B）和JL杂交组合母鸡（C）外貌特征Figure 2 The appearance of JY （A）， LK （B）and the cross JL （C）

2.4 产蛋性能

从表4可知，JL杂交组合开产日龄比LK系早13 d，比JY系早34 d，表现出明显的负向杂种优势（H=-15.41%）。JL的开产体重轻于JY系和LK系，但开产蛋重却高于二者（P＜0.05）。JL杂交组合300日龄体重与LK系相当，比JY系低14.61%。JL的开产体重与300日龄体重均表现出明显的负向杂种优势，开产蛋重则为正向杂种优势。三者间300日龄蛋重无显著差异（P＞0.05），杂交组合 300 日龄产蛋量最高，分别比JY系和LK系多25.12枚、5.31枚，杂种优势率为22.94，且杂交组合绿壳蛋率接近100%。

表4 3个群体主要产蛋性能指标及杂种优势率Table 4 The laying performance of three populations and heterosis percentage

2.5 蛋品质

从表5可知，JY系鸡蛋的蛋壳颜色、蛋白高度及哈氏单位为三者中最高，且JY系和LK系的蛋重、蛋黄颜色均高于 JL 杂交组合（P＜0.05）；LK 系的蛋黄颜色最深，蛋白高度和哈氏单位次于JY系而高于JL；JL的蛋壳厚度分别比LK系和JY系高出70.37%、43.75%，蛋壳强度分别比 LK系和 JY 系高出 25.54%、9.74%；三者之间的蛋形指数、蛋黄重差异不显著（P＞0.05）。JL的蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋形指数、蛋黄重均表现为正向杂种优势，壳色、蛋重、蛋黄颜色、哈氏单位及蛋白高度则为负向杂种优势。

表5 3个群体蛋品质及杂交组合杂种优势率Table 5 The egg quality of three populations and the heterosis percentage

3 讨论

3.1 JY系公鸡绿壳蛋基因筛选

绿壳蛋鸡是携带绿壳蛋基因而生产绿壳蛋的鸡种（品系）。原始状态下，绿壳蛋鸡群体中的绿壳基因频率较低，仅有20%～30%。由于该性状为常染色体显性遗传，表型选育中因杂合子的存在使得绿壳蛋性状选而不纯，影响选育进展[4]。本试验采用双重PCR的方法对JY系公鸡进行基因型的筛选，结果表明，所检测60个个体中携带绿壳基因的比例为23%，所占比例少，同时也说明在现代家禽育种工作中，采用分子辅助遗传标记技术相对于传统检测能够极大提高育种的工作效率。

3.2 外貌特征及生产性能

不同种群之间进行杂交后所产生的后代通常在生活力、生长速度和生产性能方面在一定程度上优于两个亲本种群的平均值，甚至优于任何一个亲本，谓之“杂种优势”[5]。杂种优势是一种重要的、可利用的遗传现象，通常以配套系的形式运用于家禽生产中，一般情况下以相对高产的品种（系）作为母本，以地方特色品种（系）作为父本，进行杂交组合后，以期获得生产性能更为优秀的商品代群体。

外貌是一个群体最直观的特征，我国消费者因乌鸡特有的药用价值、经济价值及观赏价值而对其倍加青睐。JL杂交组合母鸡为乌色单冠、乌喙、蓝耳、乌皮、黑胫、乌羽，体型较小，其外貌特征符合市场要求。JL的肤色、胫色、冠色与JY系一致，而冠型则与LK系一致。有研究表明，质量性状冠型由R基因（玫瑰冠）和P基因（豆冠）这两对互作基因控制，遵循孟德尔遗传定律。其中，单冠（pprr）为双隐性，豆冠（P-rr）则显性于单冠[6]，所选用的JY公鸡均为豆冠，LK母鸡均为单冠，而杂交后代JL则表现为单冠，故推测所选用的JY系公鸡冠型的基因型应为Pprr，但因JL群体数量不大而未实现性状分离，另一种情况或为旧院黑鸡冠型遗传规律并不同于其他家鸡，其具体分子机制尚待研究。浅肤色颜色主要受叶黄素含量的影响，白色相对于黄色为显性[7]。而黑色素的沉积则会造成家禽皮肤及衍生组织的黑色性状，主要受常染色体上的显性基因（P）及性染色体上的隐性色素扩散基因（id）二者共同影响，当有P时，黑色素细胞将遍布家禽浑身结缔组织，而id无论是杂合还是纯合情况下均使家禽的真皮层存在黑色素，而控制乌骨鸡肤色的基因有隐性伴性基因（id）和显性色素基因（Fm），且显性黑色素增色基因P和Fm具有相同的作用[8]。LK系为浅黄色皮肤，JY系为乌皮，杂交组合的皮肤及其衍生物呈现出深色亦符合遗传定律。

低遗传力的性状杂种优势更为明显，如受精率、孵化率和成活率等[9]。本试验中，JY系和LK系的受精率分别为94.29%和90.93%，而杂交后代的受精率为 96.82%，表现出较高的正向杂种优势（H=4.55%），与严华祥等[10]研究结果相符。王宏胜等研究表明，京海黄鸡三系配套系商品代孵化率优于亲本[11]，而本研究中孵化率高低依次为LK＞JL＞JY，JL杂交组合孵化率介于两个纯系之间，且杂种优势并不明显。

体重是衡量机体生长发育状况的指标之一。本试验结果显示，JL杂交组合2～10周的体重与JY系和LK系相比均表现出不同程度的正向杂种优势，与以往研究结果[12]一致，表明JL的早期体重发育较为良好，可为后期较早的开产日龄打下基础[13]。JL杂交组合开产日龄早于JY系和LK系，为129 d左右，与汪全生等报道的“京粉1号”父母代蛋种鸡123～138日龄开产相符[14]。彭星等研究表明，二郎山山地鸡开产日龄与300日龄产蛋量均呈显著负相关[15]，且在实际生产中，与经济价值密切相关的蛋鸡整个产蛋期总产蛋量是人们最关注的内容之一[16]，本研究中JL开产日龄最早且300日龄产蛋量最高，表现出明显的杂种优势，而3个群体300日龄蛋重无明显差异，说明该杂交组合的产蛋性能优于其亲本JY系与LK系。

3.3 蛋品质测定结果分析

在本试验中，采用分子标记对父本旧院黑鸡进行基因型的筛选，使得JL杂交组合群体均携带绿壳性状基因，绿壳蛋产率为100%，与预期结果相符。邓炳真等研究表明，南海黄麻鸡产蛋高峰阶段的蛋品质达到全期最好水平[17]，故本研究对3个群体30周龄（高峰期）蛋品进行了测定。结果表明，JL杂交组合30周龄的蛋重轻于JY系和LK系，而300日龄时3个群体蛋重无明显差异，表明其蛋重随日龄而逐渐增加，与刘子豪等研究相符[18]。JL杂交组合的蛋壳强度、蛋壳厚度分别为 4.62 kg/cm2和 0.46 mm，均高于JY系和LK系，表现为明显的正向杂种优势；而蛋壳颜色则深于JY系和LK系，表现为明显的负向杂种优势。蛋壳质量对于禽蛋的孵化和储存等均有重要影响，蛋壳越厚则强度越高，且一般认为蛋壳厚度高于0.35 mm时，具有良好的运输性和保存性[19]。另有研究表明，蛋壳颜色与蛋壳强度、蛋壳厚度呈中低度相关，壳色越深，家禽沉积色素时间越长，且蛋的形成过程中钙的沉积能力越强，蛋壳强度和蛋壳厚度均呈现上升趋势[20]。故JL蛋壳质量优于JY系和LK系，或与其较深的壳色有关。蛋黄颜色是一项重要蛋品评定指标，其主要受遗传和饲料中着色物质的影响，消费者更加青睐于颜色较深、色泽鲜艳的蛋黄，而蛋黄的色素积累是由蛋黄中类胡萝卜素的沉积量所决定的[21]。本研究中，3个群体蛋黄颜色深浅依次为LK＞JY＞JL，且相互间差异显著（P＜0.05）。3个群体饲料相同且家禽机体本身不能直接合成类胡萝卜素，故LK系和JY系肠道吸收色素及色素沉积能力或更强于JL杂交组合。蛋白高度和哈氏单位用以反映鸡蛋的新鲜程度，其值越高，则蛋越新鲜，蛋白黏稠度越好[22]。本研究中，在同一时间进行测量，JL杂交组合的蛋白高度和哈氏单位均低于JY系和LK系，呈现较大的负向杂种优势，表明蛋白高度和哈氏单位受遗传背景影响较大，JL的蛋白黏稠性较低，或为产蛋数量增加所带来的负面影响。

4 结论

本试验应用绿壳基因显性纯合子的分子标记辅助选择技术，获得了绿壳蛋率接近100%、具有“五黑一绿”的理想外貌特征且生产性能（早期体重、开产性能、300日龄产蛋性能、蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋壳颜色等）均优于JY系与LK系的杂交组合JL，为绿壳蛋鸡纯系选育提供了重要的参考信息。