达氏鲟和西伯利亚鲟精子超微结构的比较研究

刘 钊，赵仲孟，杨世勇，黄小丽，田 莉，杨 淞，冯 杨，段 靖，杜宗君

（四川农业大学动物科技学院，成都 611130）

精子是由雄性动物产生并传递其遗传物质的一种高度分化的细胞，其主要功能是完成受精，使物种得以延续，而在不同的物种之间精子的形态结构存在差异性。其中哺乳动物的精子的结构特征基本相同，其整体形态呈蝌蚪状，主要由头部和尾部组成，精子尾部由前向后分为颈段、中段、主段和末端，但是精子的形态在不同的哺乳动物中也有所差异，主要体现在头部[1]。与哺乳动物相比，禽类的精子也可分为头部和尾部，尾部又分为颈部、中段、主段和末端，但禽类的精子头部呈镰刀状，立体形状为长柱状，颈短尾长，外形纤细，不同的禽类精子形态在种属之间存在一定的差异[2-3]。鱼类的精子形态与禽类差异较大，与哺乳动物更为接近，但结构上存在差异，鱼类精子主要分为头部、中段和尾部3部分，头部和中段紧密相连，尾部一般为细长的鞭毛。与哺乳动物一样，鱼类的精子形态也呈蝌蚪状，但泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）[4]、大口黑鲈（Micropterus salmoides）[5]鲀、绿鳍马面 （Thamnaconus septentrionalis）[6]等大多数硬骨鱼类不具有顶体结构，而哺乳动物的精子具有顶体结构。

在硬骨鱼类中，鲟形目鱼类作为一种演化两亿多年的古老鱼类，其具有很高的经济价值：个体较大，肉肥嫩多脂，富含蛋白质，鱼卵经加工后制成的鱼子酱也是享誉世界的佳肴。鲟形目鱼类能够演化至今，其成功的繁殖策略是非常关键的，而在繁殖中精子结构起着至关重要的作用。在动物的演化过程中，动物的受精方式发生着变化，同时精子形态也在发生一系列的变化。陆生动物在适应陆生生活与体内受精的生殖方式时，其精子逐渐变长，另外发展了其他附属的尾部细胞骨骼器官[7]。和大多数硬骨鱼类一样，鲟形目鱼类的精子也是由头部、中段和尾部3部分组成，但鲟形目鱼类精子头部具有明显的顶体结构，且中段明显[8-14]，这些结构特征可能与鲟形目鱼类进化相关。

达氏鲟（Acipenser dabryanus）和西伯利亚鲟（Acipenser baerii）均属于鲟形目（Acipenseriformes）、鲟科（Acipenseridae）、鲟属（Acipenser）[15]。达氏鲟主要分布于长江流域，作为国家Ⅰ级重点保护野生动物和长江上游急切保护鱼类[16]，已成为长江上游珍稀特有鱼类国家级自然保护区的主要保护对象之一。西伯利亚鲟则主要分布于额尔齐斯河流域，经济价值高，目前作为我国人工养殖鲟鱼的主要品种之一，已在全国大面积推广养殖。达氏鲟的精子研究目前有关于其生理生态[17-18]、结构[19]及保存[20]等方面的报道，对西伯利亚鲟精子的研究主要涉及保存方法及环境因素对其结构的影响[21-23]，然而关于天然栖息水域迥异、珍稀级别不同的这两种鲟属鱼类的精子超微结构比较未见报道。本研究采用透射电镜对达氏鲟和西伯利亚鲟精子超微结构进行比较观察，以期为鲟类的种质资源的保护与利用及其繁殖生物学研究提供基础性资料。

1 材料和方法

1.1 实验材料

达氏鲟和西伯利亚鲟精子采集时间为2016年12月，来源于四川润兆渔业有限公司（军乐基地）性腺发育良好的性成熟雄性亲本（达氏鲟亲本年龄9+，体长 122.2 cm，体重 21.3 kg；西伯利亚鲟亲本年龄8+，体长 125.5 cm，体重 32.2 kg），经人工催产后获得。采集2 mL鲟鱼精液，马上用2.5%的戊二醛固定，装入样品箱中并用冰袋降温，在2 h内带回实验室4℃保存。

1.2 实验方法

透射电镜样品制备：将固定好的精液经15 000 r/min离心30 min后弃去上清液，将精子团块置于2.5%的戊二醛中保存，4℃过夜。样品经PBS缓冲液清洗3次，每次时间为10 min，然后用1%锇酸再固定 2 h，用 30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脱水，最后环氧树脂置换，浸透、包埋。超薄切片后经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，用透射电镜（日立H-600型，自带拍照系统）进行观察和拍照。

2 结果

2.1 头部

达氏鲟精子头部（图1A、图 1C）长约为 7.15 μm，由顶体和细胞核组成。顶体长约0.68 μm。顶体由顶体泡、亚顶体以及颗粒物质等组成，呈帽状覆盖在精子顶端。顶体泡位于顶体的最外层，亚顶体位于顶体泡与核区之间，且与两者结合紧密，顶体泡与亚顶体中间具顶体膜，且在顶体后外侧存在顶体后外侧延长物。细胞核由染色较深的电子致密物组成，核质分布均匀，外周质膜覆盖，膜与核结合紧密，核中无囊泡。细胞核中有3条核管（内切沟）呈螺旋形排列，从细胞核的横切面观察，3条核管之间排列似三角形，3条核管始自植入窝，一直延伸至顶体。

西伯利亚鲟精子头部（图1B、图1D）长约7.12 μm，与达氏鲟精子头部长度相近，且头部也分为顶体和细胞核两部分。西伯利亚鲟顶体长约0.83 μm，较达氏鲟精子顶体长，西伯利亚鲟精子顶体也包括顶体泡、亚顶体以及颗粒物质等，且其精子顶体也存在后侧延长物。西伯利亚鲟细胞核也是由电子密度均匀的染色质组成，外周包被核膜。但是在西伯利亚鲟精子细胞核中未发现内切沟结构。

图1 达氏鲟和西伯利亚鲟精子头部对比Figure 1 A comparison of the sperm head of Acipenser dabryanus and Acipenser baerii

2.2 中段

达氏鲟精子中段（图 2A）长度约为 1.13 μm，呈楔形沿中轴对称，由线粒体、伸入中段的轴丝以及中心粒复合体等组成。线粒体呈圆形或椭圆形位于细胞核后端质膜和核膜之间，呈环形单层排列。在中段和细胞核连接处有向核内凹陷的植入窝和纤维体结构。植入窝由膜包被呈囊状结构，纤维体位于植入窝内。植入窝之后是中心粒复合体，由近端中心粒和远端中心粒组成，近端中心粒和远端中心粒相互垂直，近端中心粒位于核植入窝正后方，由9组三联微管组成。

西伯利亚鲟精子中段（图2B）长度约为1.25 μm，相较于达氏鲟精子中段长度要长。西伯利亚鲟精子中段的形状和结构与达氏鲟的形状与结构相仿，形状呈楔形且沿中轴对称，由线粒体、伸入中段的轴丝以及中心粒复合体等组成，且分布位置相一致。

图2 达氏鲟和西伯利亚鲟精子中段对比Figure 2 The midsection of sperm of Acipenser dabryanus and Acipenser baerii

2.3 尾部

达氏鲟精子的尾部（图3A）为一条细长的鞭毛，长约为 39.33 μm，约占全长的 80.26%，由细胞质膜和轴丝组成。尾部轴丝为典型的“9+2”型双联体微管结构，轴丝的起始端与远端中心粒的末端相连，该处微管清晰，但中央微管仅见雏形，随着轴丝从袖套中的延伸，轴丝与袖套之间出现的腔越来越大。尾部中间为轴，轴两侧有翼呈扁平形。鞭毛两侧有侧鳍，侧鳍的基部分布有颗粒状物质。

西伯利亚鲟精子的尾部（图3B）也为一条细长的鞭毛，但其鞭毛长约 45.23 μm，约占全长的 84.38%，高于达氏鲟鞭毛占精子全长的比值。西伯利亚鲟精子的鞭毛同样为典型的“9+2”微管结构，且鞭毛两侧亦有侧鳍结构。

图3 达氏鲟和西伯利亚鲟精子鞭毛对比Figure 3 A comparison diagram of the sperm flagellum of Acipenser dabryanus and Acipenser baerii

3 讨论

达氏鲟和西伯利亚鲟均属于鲟形目，两者在精子结构上与其他种类的鲟形目鱼类相似，整体结构呈蝌蚪状，由头部、中段和尾部3部分组成，且头部具有顶体结构，这一特点与其他硬骨鱼类差异明显。在有关动物精子结构的报道中，哺乳动物和禽类的精子头部均具有明显的顶体结构[1-3]，而大多数硬骨鱼类的精子头部无顶体结构，但在鲟类如中华鲟（Acipenser sinensis）的精子头部前端发现明显的伞状顶体[26]。顶体是位于精子头部最前端的帽状结构，相当于普通细胞内的溶酶体，内含多种酶类。因此可见，顶体结构对提高受精率有重要作用，鲟形目鱼类精子头部的顶体结构可能是其在长期进化过程中为了适应环境不断演化而来，是鲟鱼类保持其物种延续的重要策略。同时在两种鲟鱼之间的精子顶体结构都存在后外侧延长物（PLP），与郭威[19]、章龙珍等[21]的研究结果基本一致。而目前研究对PLP结构功能还尚未有定论，但有部分学者认为在受精过程中顶体后外侧突出物可以锚定在卵上[27]，因此PLP结构的功能可能与提高受精率相关。

顶体后紧接着是细胞核，不同动物的细胞核形状差异较大。马鹿（Cervus elaphus）[28]、绵羊（Ovis aries）[29]等有蹄类动物的精子细胞核为扁卵圆形；人（Homo sapiens）[30]、东北虎（Panthera tigris altaica）[31]的精子细胞核呈犁形；大鼠（Rattus norvegicus）[32]、小鼠（Mus musculus）[33]的精子细胞核呈镰刀状；大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）[34]呈豆瓣状，鸵鸟（Struthio camelus）[2]、火鸡（Meleagris gallopavo）[3]的细胞核呈长棒状结构，而本实验研究的两种鲟鱼的精子细胞核呈短棒状结构，与哺乳动物和鸟类都不相同，与泥鳅[4]、大口黑鲈[5]、川陕哲罗鲑（Hucho bleekeri）[24]、齐口裂腹鱼（Schizothorax plagiostomus）[25]等大多数硬骨鱼类的精子细胞核为圆形的特征也不相同[35]，这可能是和鲟鱼适应环境相关。本研究中两种鲟鱼精子细胞核局部构造存在差异，达氏鲟细胞核中发现内切沟，这一结构在西伯利亚鲟的精子细胞核中没有观察到，有研究表明内切沟可能在受精时维持精子细胞核呈锥状进入卵内有关[36]，有利于提高达氏鲟受精率。

在本研究中发现，达氏鲟和西伯利亚鲟精子尾部鞭毛相似，两侧均长有侧鳍，侧鳍结构并非是种属间的特异性结构，在其他种类鲟鱼[8-14，17]以及其他硬骨鱼类[5，24-25]精子超微结构的研究中也发现侧鳍结构，但在部分鱼类[4，6，37-38]的精子尾部鞭毛无侧鳍结构。目前为止，对于侧鳍的生物学功能仍不是十分清楚，M.N.Dilauro等[8]认为侧鳍是对体外受精的适应，有助于提高精子游动速率。但有学者认为鞭毛的鳍状物与受精环境并没有相关性，因为发现在许多体内受精的鱼类鞭毛中也出现了鳍状结构[39]。此外，本研究还发现两种鲟鱼精子侧鳍的基部分布着许多小的颗粒状物质，这些颗粒状物质可能与提高精子的运动速度有关，有助于提高鲟鱼受精率。