一种高纯度缬草三酯的制备工艺

浦绍敬 李剑峰 王小婷

【摘 要】 目的：提供一种制备高纯度缬草三酯的工艺方法。方法：该工艺包括，利用超临界CO2萃取蜘蛛香的挥发油与非挥发性组分，同時实现解析分离;采用柱层析纯化，用不定型正相硅胶作固定相，乙酸乙酯和石油醚（V∶V=15∶85）作流动相洗脱。 结果：连续两次洗脱即可得到高纯度缬草酸酯，室温下呈淡黄色油液，相对浸膏收率18.6%。其化学结构经NMR和MS表征，确定是4-（乙酰氧甲基）-6，7-二氢-1H-螺[环戊烷][c]吡喃-7，2'-环氧乙烷〗-1，6-双-3-缬草酸酯，CAS NO. 18296-44-1。结论：该工艺提取效率高，提取过程中目标物不被破坏，纯化方法简单，损失小，得到的缬草三酯纯度高，为后续药理及活性研究提供可靠的原料保障。

【关键词】 乙酰缬草三酯;缬草三酯;超临界萃取;蜘蛛香;环烯醚萜类

【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）22-0032-04

A Preparation Process of High Purity Valepotriate

PU Shaojing1 LI Jianfeng2* WANG Xiaoting1

1.Shureli Biopharma Co.，Ltd.Kunming 650000，China;

2.School of traditional Chinese Medicine， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650000，China

Abstract：Objective A novel process was provided about the preparation of valepotriate with high purity.Methods The process encompassed two sections. The first section achieved primary separation whereby  the volatiles and the non-volatiles were extracted with supercritical liquid carbon dioxide and subsequently partitioned to different units.  In the second section， the non-volatile fraction was further purified with silica gel column chromataography， eluted with mixed solvents of ethyl acetate and petroleum ether （15∶85 v/v）. Results After repetition of chromatography by once， valeriene with 91% purity （HPLC） was obtained. The product was a yellow oil. The yield was 18.6% based on the crude extract. The structure of the product was established by comparing the NMR and MS data， which was valepotriate （CAS. 18296-44-1）. Conclusion The process features high yield， mild conditions， easy purification and low loss. The product valepotriate thus obtained has fairly high purity， which can be used in the subsequent studies on the pharmaceutical and biological activities thereof.

Keywords：Valeriene; Valepotriate; Supercritical CO2 Extraction;Valeriana jatamansi Jones; Iridoids

蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）是敗酱科（Valerianaceae）缬草属植物蜘蛛香或V. wallichii DC的根茎，又名马蹄香、鬼见愁、豆菜根、九转香、雷公七、小马蹄香、臭狗药、磨脚花、老龙须、香草子、养血莲、臭药、乌参、大救驾、老虎七等[1-3]。蜘蛛香为多年生草本植物，主要分布在我国西南地区，资源丰富，曾收录于2010年版中国药典，具有理气止痛、消食止泻、祛风除湿、镇静安神的功效，常用于腹脘胀痛、食积不化、腹泻痢疾、风湿痹痛、腰膝酸软、失眠等，缬草三酯是蜘蛛香主要活性成分和质量控制指标[4]。蜘蛛香的化学成分主要包括挥发油、环烯醚萜类和黄酮类化合物[5]，研究表明，蜘蛛香中的环烯醚萜类成分有镇静催眠、抗焦虑、抗病毒、解痉、舒张血管、松弛平滑肌和抗肿瘤等活性[6-10]。缬草三酯的化学结构在1982年已有报道，其从印度缬草中提取分离而得，含量较少。该结构经过证实具有很好的肿瘤细胞毒性，一定剂量即可杀死肝癌细胞，且未见妊娠毒性和其他毒性[11]。缬草三酯与乙酰缬草三酯化学结构相似，具有一定的稳定性，能经受短时强光照射和高温，能耐受一定的酸性，对碱性不耐受，降解主要表现为酯键的水解[5]。本研究的主要意义在于，该工艺可以解决传统提取工艺提取效率低、产物损失大、环境友好性差、药材浪费等缺点。该工艺提取时间短、无废气废水、收率高、不破坏活性成分，是目前蜘蛛香提取的最佳工艺。

1 仪器、设备和试药

1.1 仪器 岛津L2030 HPLC，VWD检测器，工作站版本V 5.87;AB265-S分析电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）;BRUKER AVⅢ HD 600核磁共振波谱仪;Agilent 6470 Triple Quad LC/MS液质连用仪。

1.2 设备 TH22-50*2中型超临界CO2萃取设备（上海成东科技有限公司）;EZ PLUX 200D型中低压制备液相（利惠科技）。TH22-50*2中型超临界CO2萃取设备的结构包括：2个50 L萃取罐、1个二级分离罐、1个三级分离罐和一个冷凝器，萃取罐可交替使用，冷凝器用于CO2回收。

1.3 试剂与药材 乙酸乙酯、石油醚（二类）均为分析纯，乙腈为色谱纯（默克公司），水为娃哈哈瓶装纯净水。蜘蛛香药材购自云南白药集团股份有限公司中药饮片分公司、 云南向辉药业有限公司和昆明道地中药饮片厂。有切片和未切片两种，生产日期均已超过两年。

2 方法

2.1 超临界萃取 将切片与未切片的蜘蛛香药材分别粉碎，无需过筛。分别装入萃取釜中，调节萃取温度50～55 ℃，待温度达到后开启CO2流量，控制在38～40kg/h范围内，控制萃取压力在30～35Mpa范围内;一级分离罐解析压力调节为10～15Mpa，温度为40～45℃;二级分离罐解析压力调节为2～5Mpa，温度为20～25℃，连续萃取120min。非挥发性组分储存于一级分离罐的下部，挥发油储存于二级分离罐的下部，少量挥发油被携带到三级分离罐和冷凝器，提取完成后与二级分离罐合并。

2.2 纯化 以300～400目正相不定型硅胶作为固定相，湿法上样，以乙酸乙酯与石油醚体积比15∶85作为流动相进行洗脱，收集UV 254nm集中吸收部位，将该部位浓缩后进行第二次柱层析，降低乙酸乙酯与石油醚的比例至10∶90，浓缩既得黄色油状液体。

2.3 含量测定 取上述2.2油状液体2mg，加乙腈10mL溶解，取1.5mL溶液过0.22um滤膜备用。使用岛津L2030 HPLC进行纯度分析，采用面积归一化法计算相对含量。色谱柱：WondaSil C18 Superb（4.6mm×250mm，5μm）;柱温：30 ℃;流动相：乙睛∶水=70∶30，等度洗脱;流速：1.0mL/min;检测波长： 254nm;进样量：2μL。

2.4 结构分析

2.4.1 NMR 取上述2.2油状液体10mg于核磁管中，加入0.5mL氘代氯仿溶解，置BRUKER AVIII HD 600核磁共振波谱仪，分别扫描1H NMR和13C NMR。

2.4.2 MS 取上述2.2油状液体0.1mg，加甲醇1.5mL溶解，过0.22μm滤膜备用。取1μL注入Agilent 6470 Triple Quad LC/MS液质连用仪，Fragmentor 165，扫描范围m/z： 50～1000。

3 结果与讨论

3.1 意义 近年来，关于蜘蛛香活性成分和临床运用的相关研究越来越多，且蜘蛛香是目前临床用于治疗婴幼儿腹泻效果最佳的中成药。对于蜘蛛香各组分的生物活性研究已经清楚，但鲜见提取纯化方面有何进展。本实验提供一种全新高效提取工艺，弥补蜘蛛香提取工艺的缺失和缺陷。目前云南大健康产业蓬勃发展，中药现代化就是其中非常重要的一项工作，先进的提取工艺可以推动中药现代化的进程。

3.1 结构确认 上述2.2所得黄色油液经MS确认分子量与图4所示结构相同。ES-MS （m/z）：445.1844[M+Na]+。经核磁表征，1H NMR、13C NMR与已知文献数据对比完全一致[13]：1H NMR（600 MHz，CDCl3） δ 6.68 （s， 1H）， 5.96 （dd，J=10.1，4.5 Hz， 1H），5.85（t，J=2.8 Hz，1H），5.37-5.33（m，1H），4.74-4.62（m， 2H），3.42（dd，J=10.1，2.5 Hz， 1H），3.02（dd，J=10.0， 5.0 Hz，1H），2.89（d，J=4.9 Hz， 1H），2.23-2.20（m， 2H），2.17（d，J=7.1 Hz， 2H），2.14-2.06（m， 2H），2.04（s， 3H），0.98（s， 3H），0.97（s， 3H），0.94（s， 3H），0.93 （s， 3H）;13C NMR（151 MHz， CDCl3）δ172.42，170.82，170.27，148.47，140.93，118.64，108.35，92.58，83.05，64.16，60.81，47.86，43.37，43.04，43.02，25.81，25.59，22.33，22.31，22.30，22.21，20.91. 以上数据确认该工艺所得缬草三酯化学结构正确无误。

3.2 切片对含量的影响 实验证实，相同提起工艺下，未切片蜘蛛香原药材中挥发油占比5%～6%，非挥发性成分占比3.5%～4.2%;经过切片的蜘蛛香饮片中挥发油占比2%～3%，非挥发性成分占比约1%，且随着切片时间越长，含量越低。蜘蛛香的主要成分是挥发油、环烯醚萜类和黄酮类，饮片切片工艺直接破坏蜘蛛香原有保护层，导致挥发油和环烯醚萜类成分更容易揮发和破坏。饮片生产工艺不适用于蜘蛛香药材，蜘蛛香药材最佳保存条件应该是阴凉避光全株保存。

3.3 超临界CO2萃取技术用于蜘蛛香提取的优点 沸点较低，蒸馏试验发现，常压下挥发油沸点集中在95～110 ℃范围内;另外，环烯醚萜类化合物在高温下易坏。传统提取方法往往采用高温蒸煮，在提取过程中，挥发油和缬草三酯损失严重，超临界CO2萃取技术可以避免上述缺陷。除此之外，超临界CO2萃取技术还具有如下优点：① 效率高，时间短，无需清洗，可连续生产;② 条件温和，收率高，提取过程中损失较小;③ 无溶剂，无需做任何除溶剂处理;④ 分离效果好，可以直接将挥发油与其他成分分离;⑤ 得到的浸膏中缬草三酯含量较高，便于后续纯化。

3.4 关于后续纯化方法的建议 本实验使用中低压过柱，无法达到更高的分离度，只对缬草三酯进行初步分离。HPLC图谱如图1所示，缬草三酯的保留时间13.4 min，其主要杂质分别位于12.7 min和17.0 min处，据核磁数据分析，推测杂质可能是缬草三酯的类似物。核磁HNMR图谱和CNMR图谱分别如图2、图3所示，未发现明显杂质峰。实验不对杂质进行研究，在此不做讨论。后续分离，建议采用正相高压制备液相进行纯化，使用目数更小的硅胶做固定向，采用梯度洗脱，达到更好的分离效果。

参考文献

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（收稿日期：2019-08-15 编辑：程鹏飞）