咳尔康颗粒对肺腺癌细胞A549的体外抗肿瘤作用*

侯广玉，李孟全，赵鹏程，王一成，朱立双，杜书迪

(黑龙江省肿瘤疾病防治重点实验室、牡丹江医学院，牡丹江 157011)

恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疑难疾病，根据国家癌症中心报道，全球恶性肿瘤发病率和死亡率均呈上升趋势[1]。恶性肿瘤的常规医治方法，诸如手术、放射治疗、化学治疗、生物治疗等，虽然可以最大限度地减瘤负荷，但是副作用较大，容易复发转移[2]。中药抗肿瘤具有多靶点、多效应、不良反应小、不易产生耐药性等优势[3]。咳尔康颗粒为中药制剂，其组方是在古方二陈汤基础之上加味衍化而成，主要药味包括半夏、黄芩、茯苓、甘草、陈皮等。本课题组前期研究结果显示该方剂不仅具有止咳、祛痰、平喘和抗炎作用，同时具有抗菌、抗病毒、提高机体免疫力之功效[4-8]。近年文献报道其中主要药味具有抗肿瘤活性[9-13]，提示该方剂有望开发成特色有效的抗肿瘤中药。本研究制备咳尔康颗粒，参照《中华人民共和国药典》(2015年版)建立其高效液相色谱法(HPLC)质量控制标准[14]以监控质量；观察咳尔康颗粒对肿瘤细胞A549细胞形态、细胞核形态、细胞增殖与凋亡以及相关基因mRNA表达的影响，为开发抗肿瘤中药资源提供基础数据。

1 材料与方法

1.1细胞株 人肺腺癌细胞株A549购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

1.2药物 中药饮片：茯苓(安徽岳西，批号：14040006)、清水半夏(甘肃清水，批号：13110016)、甘草(内蒙古杭锦旗，批号：14040024)、紫菀(河北安国，批号：13090051)、黄芩(河北燕山，批号：13090030)、陈皮(福建泉州，批号：13030009)，以上中药饮片购自安国市同義中药饮片有限公司；糊精、淀粉(安徽山河药用辅料股份有限公司)；黄芩苷(上海源叶生物科技有限公司，批号：PS0912SB13)。

1.3试剂 高糖达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基(HyClone公司，批号：AAM09207)；胎牛血清(Bioclot lot，No.1964)；噻唑蓝(MTT，Sigma公司，MKBB1495)；DAPI染色液(Sigma公司，批号：D9542)；RNA提取试剂盒( OMEGA R6812)、逆转录试剂盒(Roche 04897030001)、SYBR Green(Roche 04913914001)、甲醇(色谱纯，天津市永大化学试剂有限公司，批号：20130716)，无水乙醇和磷酸均为分析纯，购自哈尔滨市龙盛精科化学试剂有限公司。

1.4仪器 高效液相色谱仪(LC-10A，日本岛津公司)；二氧化碳(CO2)恒温培养箱(Thermo Forma 371型)；倒置相差显微镜(Leica DM IL LED)；多功能读板机(SpectraMax®M3)；荧光倒置显微镜(Olympus IX73)；酶联免疫链式反应(PCR)分析仪(MycyclerTMThermal cycler 580BR11617，BIO-RAD，U.S.A.)；实时定量PCR分析仪(StepOneTMReal-Time PCR System 271000894，ABI，Singapore)。

1.5实验方法

1.5.1咳尔康颗粒的制备及其质量控制 处方药材速洗、水煎、浓缩，加入辅料淀粉糊精混合制备咳尔康颗粒，依法[14]建立咳尔康颗粒HPLC质量控制标准。根据其中已知成分黄芩苷对人肺腺癌A549 细胞具有抑制作用[10]，所以选用黄芩苷作为咳尔康颗粒含量控制指标。采用Hypersil ODS2色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-0.4% 磷酸(50：50)洗脱，流速为1.0 mL·min-1，检测波长278 nm。以流动相制备颗粒剂供试溶液和黄芩苷标准溶液，经孔径0.45 μm滤膜滤过，进样量20 μL。色谱行为见图1，以峰面积对浓度进行线性回归，得回归方程Y=63 065X-14 594(r=0.992 9，n=6)，平均加样回收率98.03%，RSD=2.571%(n=5)。采用此方法测得咳尔康颗粒中黄芩苷含量0.349 8‰。

A.供试溶液； B.标准溶液； C.流动相

Fig.1HPLCchromatogramofthreekindsofsolution

1.5.2含药血清培养液的制备 精密称取咳尔康颗粒1.325 g，加10%胎牛血清的高糖DMEM培养液10.00 mL，磁力搅拌30 min，经孔径0.22 μm滤膜滤过除菌，即得浓度为132.5 g·L-1咳尔康颗粒储备液，保存于-70 ℃备用，临用时加10%胎牛血清的高糖DMEM培养液稀释成系列工作浓度。根据黄芩苷对人肺腺癌A549 细胞具有抑制作用[10]，所以选用黄芩苷作为阳性对照药物。精密称取黄芩苷对照品1.445 mg，加10%胎牛血清的高糖DMEM培养液10.00 mL，磁力搅拌30 min，经孔径0.22 μm滤膜滤过除菌，即得浓度为0.1445 g·L-1黄芩苷对照品工作液，保存于-70 ℃备用。

1.5.3细胞培养及传代 肿瘤细胞A549接种于25 cm2培养瓶中培养，培养时每瓶加入培养液(培养液配制：10%胎牛血清+1%双抗+89%DMEM高糖培养基)4～5 mL。培养箱环境设定为37 ℃、CO2含量为5%。新种植的细胞在培养箱中孵育2～3 d，当瓶底细胞密度达到80%，进行细胞传代。吸弃旧液，PBS轻柔洗涤2次，以0.25%胰酶消化至圆形，依据细胞量进行1：2或者1：3传代，再放入培养箱中培养。

1.5.4MTT法检测细胞增殖 取对数生长期A549肿瘤细胞调整密度为4×105·mL-1，接种在96孔板内，每孔100 μL，置于培养箱中培养12 h。咳尔康组换上不同浓度的咳尔康颗粒血清培养液，黄芩苷组换上0.1445 g·L-1黄芩苷血清培养液，正常对照组加入相同体积的血清培养液，每组设7个平行孔，培养36 h。弃去上清液，每孔加入新鲜配制0.5 g·L-1MTT的培养液200 μL，继续培养4 h。弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，震荡10 min，酶标仪570 nm测定每孔的吸光度值(A)。抑瘤率(%)=(1-A药物组/A正常对照组)×100%。

按照钟昕[8]方法测定裂褶多糖的重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)和分散系数(Mw/Mn)。采用Astra软件进行数据分析。

1.5.5细胞形态观察及4，6-联脒-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色后细胞核形态观察 取对数生长期A549肿瘤细胞调整密度为4×105·mL-1，接种在含有盖玻片的6孔板内，每孔1 mL，置于培养箱中。约6 h细胞贴壁后，咳尔康组分别换上高、中、低浓度(通过MTT实验确定)的咳尔康颗粒血清培养液，黄芩苷组换上0.1445 g·L-1黄芩苷血清培养液，正常对照组加入相同体积的血清培养液，每组设3个平行孔，培养36 h，光镜下观察细胞形态变化。吸出培养液，4%甲醛固定1 h；PBS洗3次。取出盖玻片置于玻璃平皿中，二甲苯洗5 min，100%→0%乙醇梯度洗脱，梯度为10%。每孔加入2 mg·L-1DAPI染色液，避光染色10 min，去除染色液，双蒸水洗3次，树胶封片，荧光显微镜下观察细胞核形态。

1.5.6实时定量PCR检测基因表达 将4×105·mL-1A549肿瘤细胞接种在6孔板中，每孔3 mL，置于孵箱中。约6 h细胞贴壁后，咳尔康组分别换上高、中、低浓度(通过MTT实验确定)的咳尔康颗粒血清培养液，黄芩苷组换上0.1445 g·L-1黄芩苷血清培养液，正常对照组加入相同体积的血清培养液，每组设3个平行孔，培养36 h。提取总RNA、逆转录为cDNA(按说明书操作)，用实时定量PCR系统检测基因c-myc、c-fos、bax、bcl-2 和caspase-9 mRNA表达，引物序列见表1。

表1实时定量PCR分析的基因引物序列

Tab.1Primersequenceofreal-timequantitativePCR

基因引物名称引物序列(5' → 3')扩增片段长度/bp退火温度/℃c-mycFGGCTCCTGGCAAAAGGTCA11962.2RCTGCGTAGTTGTGCTGATGT60.4c-fosFGGGGCAAGGTGGAACAGTTAT12662.1RCCGCTTGGAGTGTATCAGTCA61.5blc-2FGGTGGGGTCATGTGTGTGG8962.6RCGGTTCAGGTACTCAGTCATC61.8baxFCCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG15562.1RCCAGCCCATGATGGTTCTGAT61.9caspase-9FCTCAGACCAGAGATTCG-CAAAC11660.9RGCATTTCCCCTCAAACTCT-CAA60.5GAPDHFAGAAGGCTGGGGCTCATTTGRAGGGGCCATCCACAGTCTTC

实时定量PCR扩增反应的条件为95 ℃预变性5 min 1个循环后，每个循环变性95 ℃、30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45个循环，采集循环退火后的荧光信号，结果分析时以GAPDH为内参，用2-ΔΔCT法检测mRNA的相对表达量。

2 结果

2.1咳尔康颗粒剂对A549肿瘤细胞增殖的影响 采用MTT法检测细胞增殖，结果见表2。与正常对照组比较，黄芩苷组的A值显著降低，抑瘤率14.00%；咳尔康组随着咳尔康颗粒剂浓度的增加其A值逐渐降低，呈现出剂量依赖性抑制肿瘤细胞增值作用(F=83.40，P<0.01)。根据抑瘤率的量效关系求算半效抑瘤浓度(IC50)为74.07 g·L-1。

表27组细胞增殖情况比较

组别药物浓度/(g·L-1)A(n=7)抑瘤率/%正常对照组——2.916±0.038—黄芩苷组黄芩苷0.144 52.508±0.157*114.00咳尔康1组咳尔康颗粒0.132 52.814±0.0642.59咳尔康2组咳尔康颗粒1.3252.841±0.0843.51咳尔康3组咳尔康颗粒2.5602.577±0.167*211.64咳尔康4组咳尔康颗粒13.252.571±0.069*111.84咳尔康5组咳尔康颗粒132.50.417±0.061*185.71

与正常对照组比较，*1P<0.01，*2P<0.05

Compared with normal control group，*1P<0.01，*2P<0.05

2.2咳尔康颗粒剂对A549细胞形态及细胞核形态的影响 采用光学显微镜观察细胞形态，采用荧光显微镜观察DAPI染色细胞核形态，结果见图2。正常对照组的细胞形态完整，生长良好。咳尔康组随着咳尔康颗粒浓度的增加出现体积缩小，与周围的细胞脱离，细胞数量逐渐减少，生长状况越来越差，并出现悬浮细胞；DAPI染色后，正常对照组的细胞核比较规则，近乎圆形，染色质均匀，核膜完整。咳尔康组随着咳尔康颗粒浓度的增加逐渐出现核质浓缩，颗粒物质出现，荧光强度增大，核质外溢，核膜破碎，最终形成凋亡小体。

2.3咳尔康颗粒对A549肿瘤细胞基因表达的影响 采用实时定量PCR比较CT值(2-ΔΔCT法)检测A549肿瘤细胞中原癌基因和凋亡基因mRNA的表达，结果见图3。与正常对照组比较，随着咳尔康颗粒浓度的增加，咳尔康组原癌基因c-myc和c-fos的mRNA表达量呈现剂量依赖性降低；凋亡基因bax/bcl-2比值和caspase-9的mRNA表达量呈现剂量依赖性升高。

A.正常对照组；B.低浓度咳尔康组(1.325 g·L-1)；C.中浓度咳尔康组(2.560 g·L-1)；D.高浓度咳尔康组(13.25 g·L-1)；E.黄芩苷组(0.1445 g·L-1)

图25组A549肿瘤细胞的细胞形态与细胞核形态

A.normal control group；B.low-doseKeerkanggroup(1.325 g·L-1)；C.medium-doseKeerkanggroup(2.560 g·L-1)；D.high-doseKeerkanggroup(13.25 g·L-1)；E.baicalin group(0.1445 g·L-1)

Fig.2MorphologyofcellsandnucleusinfivegroupsofA549tumorcells

A.正常对照组；B.低浓度咳尔康组(1.325 g·L-1)；C.中浓度咳尔康组(2.560 g·L-1)；D.高浓度咳尔康组(13.25 g·L-1)；E.黄芩苷组(0.1445 g·L-1)；与正常对照组比较，*1P<0.01，*2P<0.05

A.normal control group；B.low-doseKeerkanggroup(1.325 g·L-1)；C.medium-doseKeerkanggroup(2.560 g·L-1)；D.high-doseKeerkanggroup(13.25 g·L-1)；E.baicalin group(0.1445 g·L-1)；Compared with normal control group,*1P<0.01，*2P<0.05

3 讨论

中医学认为痰湿体质与肿瘤具有高度相关性[15]。中医讲的痰湿亦称之为痰，即广义的痰，是人体内的水液津液凝结而成的黏稠物或者块状物。《丹溪心法》曰：“凡人身上、中、下有块者多是痰”。中医讲怪病多痰，就是说凡是治不好的怪病大多是体内有痰。痰湿会影响到气血运行、物质代谢、细胞正常生长以至于生成肿瘤。中医古方“二陈汤”由法半夏、陈皮、茯苓、甘草组成。其中半夏燥湿化痰、降逆和胃，为君药；陈皮燥湿祛痰并善理气健脾，其与半夏相配共祛湿痰、调畅气机、使胃气得和，为臣药；茯苓健脾渗湿，其与陈皮相伍则脾湿得化、脾气得畅而助君药祛痰之功，为佐药；甘草既助茯苓健脾和中，又调和诸药而兼润肺，为使药。整方具有燥湿化痰、理气和中之功效。近年报道以二陈汤为基础随证加减有助于治疗恶性肿瘤[16-17]。本研究在二陈汤基础之上加味衍化，制得咳尔康颗粒剂。参照《中华人民共和国药典》(2015年版)指导原则建立该制剂的HPLC质量控制标准，为进一步可重复地研究提供前提保障。

按咳尔康颗粒剂中黄芩苷的含量为0.3498‰计算，高浓度咳尔康(132.5 g·L-1)中黄芩苷的含量是0.046 g·L-1，显著低于黄芩苷组黄芩苷的浓度(0.1445 g·L-1)，所以咳尔康颗粒剂对肺腺癌细胞A549体外抗肿瘤作用并非一定是黄芩苷的作用，实际上可能是其多种成分共同作用的结果[9-13]。

黄芩苷组主要有两方面作用：一方面说明实验的有效性，假如阳性对照无效，说明该实验存在问题；另一方面是比较受试药物与阳性药物的药效，评价受试药物药效的优劣。本研究以黄芩苷为阳性对照，主要是用于说明实验的有效性。之所以没用黄芩苷评价咳尔康颗粒药效的优劣，是因为咳尔康颗粒的药效并非一定是黄芩苷的作用，可能是多种成分共同作用的结果，加之本研究内容主要是机制方面，因此与黄芩苷作用的比较难以评价咳尔康疗效的优劣。

本研究结果显示，与正常对照组比较，咳尔康颗粒具有剂量依赖性抑制A549肿瘤细胞增殖作用，即随着药物浓度的升高其抑制率增大。

细胞形态和数量的变化是药物体外抗肿瘤活性最直观指标。本研究在光学显微镜下观察到咳尔康颗粒剂影响肿瘤细胞的形态和数量。DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，产生比DAPI自身强20多倍的荧光，在荧光显微镜下可以看到细胞核的形态变化。DAPI染色常用于细胞凋亡检测。本研究DAPI染色结果表明咳尔康颗粒剂可诱导肿瘤细胞凋亡。

原癌基因c-myc和c-fos编码的核转录因子与启动子和增强子序列结合，促进生长促进基因的转录，从而促进细胞增殖。这类基因在肿瘤细胞中过度表达。本研究实时定量PCR显示，咳尔康颗粒剂可抑制肿瘤细胞原癌基因c-myc和c-fos的mRNA表达，推测此作用与其抑制肿瘤细胞增殖的机制相关联。促凋亡基因bax 表达产物Bax蛋白能自身形成同源二聚体Bax/Bax，提高线粒体通透性，使细胞色素C释放出来，促进细胞凋亡。抗凋亡基因bal-2表达产物bal-2蛋白能与bax形成异源二聚体bal-2/bax，从而抑制bax发挥作用。因此bax/bal-2或bal-2/bax比例是决定细胞进入凋亡与否的关键因素。凋亡基因caspase-9表达产物caspase-9蛋白为线粒体/细胞色素C介导的凋亡通路中重要成员，可激活其下游蛋白caspase-3，导致细胞凋亡。本研究实时定量PCR显示，咳尔康颗粒剂可提高bax/bcl-2的mRNA表达比例，提高caspase-9的mRNA表达，推测此作用与其促进肿瘤细胞凋亡的机制相关联。

(志谢：本研究的实验过程得到牡丹江医学院赵冰海博士、李洪志老师以及牡丹江医学院大学生科研创新团队肖圆圆和于梦书同学的鼎力相助，在此一并表示诚挚谢意。)