Box-Behnken设计优选复方五花颗粒的提取工艺

周光姣，黄 翔

(1.安徽中医药科学院亳州中医药研究所，安徽 亳州 236800；2.亳州职业技术学院，安徽 亳州 236800；3.安徽中医药大学，安徽 合肥 230031)

复方五花颗粒是在部颁标准《中药成方制剂》第十册WS-3B-1962-95的金菊五花茶颗粒的基础上，加减而成的中医临床经验方制剂，由葛花、菊花、槐花、白扁豆花和金银花五味中药组成.具有清热化湿、解酒醒脾、降血脂之功效[1-3].临床主要用于降血脂和醒酒，效果显著.临床使用采取简单的煎煮得滤液饮服，但工艺不统一、不稳定，缺乏科学性，本课题组通过系统考察各影响因素，优选复方五花颗粒的最佳提取工艺，为深入开发本方提供实验基础.

1 实验材料

1.1 受试药物

葛花、菊花、槐花、白扁豆花等药材购于亳州三義堂中药饮片有限责任公司，经亳州职业技术学院叶胜名副教授鉴定：金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花；菊花为菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥头状花序；葛花为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi干燥花；白扁豆花为豆科植物扁豆dolichos lablabL.干燥花的炮制加工品；槐花为豆科植物槐Sophora japonicaL.的干燥花及花蕾.

1.2 试剂

芦丁对照品(HPLC，纯度为 98.94%，批号：100080-201608，中国药品生物制品检定院)；无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠(均为分析纯，购自天津市光复科技发展有限公司，分析纯)；纯净水本实验室自制.

1.3 仪器

UV752PC紫外可见分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司)；SH2-D(III)循环水式多用真空泵(河南省予华仪器有限公司)；RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；RE-201D升降恒温水浴锅(青岛华青集团有限公司)；FA2204电子天平(常州市幸运电子设备有限公司)；JC101型电热鼓风干燥箱(上海天祥药械制造厂).

2 方法与结果

复方五花颗粒临床上主要是以汤剂的形式运用，且药材中的主要成分均具有较好的水溶性，综合考虑制成颗粒剂后的工业化生产，节约能耗等问题，本实验用水煎煮法[4]提取.以总黄酮提取率和干浸膏得率的综合得分为考察指标，采用单因素试验结合响应面法优选提取工艺.

2.1 复方五花颗粒总黄酮的含量测定

2.1.1 总黄酮提取率的测定方法

取样品溶液1 mL加0.4 mL 5%亚硝酸钠溶液，混匀，静置6 min，再加0.4 mL 10%硝酸铝溶液，混匀静置6 min.加4%氢氧化钠溶液4 mL后用70%乙醇定容至10 mL，混匀静置15 min.在510 nm处测吸光度，外标法计算总黄酮的浓度[5]，总黄酮提取率=总黄酮的浓度×总稀释倍数/药材重量

2.1.2 芦丁对照品溶液的配制

精密称取芦丁对照品10.02 mg，加70%乙醇定容至50 mL，摇匀，即得浓度为0.2004 mg/mL芦丁对照品溶液[6].

2.1.3 样品溶液的制备

按处方比例称取各药材共50 g，浸泡30 min，加20倍量的水煎煮0.9 h，滤过，滤渣加15倍量水第二次煎煮，合并两次煎煮滤液，浓缩至相对密度为1.15-1.35，减压干燥得样品干膏[7-8].取0.2 g干浸膏，70%乙醇溶解并定容至50 mL，得样品溶液.

2.1.4 检测波长的选择

分别吸取一定量的样品和对照品溶液，使用硝酸铝显色法，显色，在200～700 nm的波长范围内扫描.结果表明两者均在510 nm的波长处有最大吸收峰，阴性溶液和背景溶液无干扰，因此本课题组选用510 nm作为检测波长.

2.1.5 线性关系考察

用移液枪分别精密移取芦丁对照品溶液0.2、0.5、1、1.5、2.0、2.5 mL，分别加 5% 亚硝酸钠溶液0.4 mL，混匀，静置6 min，再加10%硝酸铝溶液0.4 mL，混匀，静置6 min，最后加4%氢氧化钠溶液4 mL，70%乙醇定容至10 mL，混匀，静置15 min[9-10].在510 nm处测吸光度，以浓度对吸光度，线性回归，得回归方程为Y=0.0128X-0.002(r=0.9999)，说明在4.08～50.10 μg/mL范围内，线性关系良好.

2.1.6 精密度考察

精密移取芦丁对照品溶液1.0 mL，按“2.1.1”项方法，重复6次测定溶液的吸光度，RSD=0.42%，表明设备精密性良好.

2.1.7 稳定性考察

精密移量取同一批次样品溶液 1.0 mL，按“2.1.1”项方法，分别于 0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、18 h、36 h后测定吸光度，RSD=0.62%(n=6)，表明36h内供试品溶液稳定性较好.

2.1.8 重复性考察

精密量取6份1 mL的样品溶液，按“2.1.1”项方法，测定吸光度，RSD=1.15%(n=6)，表明重复性良好.

2.1.9 加样回收考察

量取0.5 mL供试品溶液共6份，每份加入0.5 mL芦丁对照品溶液，按“2.1.1”项方法测混合溶液的吸光度，计算加样回收率.平均回收率98.73%，RSD=1.34%(n=6)，加样回收率符合要求.

2.2 干膏得率的测定

精密称定每份原药材重量记W1，提取、浓缩干燥后干膏重量记 W2，按公式干膏得率 =W2×100%/W1，计算即得.

2.3 水提工艺单因素实验

设定其它工艺参数条件不变，分别探究液料比、煎煮时间、煎煮次数对五花浸膏中总黄酮含量和干浸膏得率综合评分的影响.将综合评分满分设为100分，总黄酮含量及干浸膏得率的权重比分别为60、40，在此基础上进行加权评分.综合评分=总黄酮提取率×0.6/最大总黄酮得率+干膏得率×0.4/最大干膏得率[11]，见表1.

表1 单因素变化条件Table 1 Single factor variation conditions

2.3.1 液料比对综合评分的影响

按照“表1”中动态条件试验，并计算出试验结果的综合评分，绘制液料比对综合评分曲线图，见图1(A).复方五花提取液综合评分随液料比呈现峰形，当液料比为20∶1时处于峰顶，两侧逐渐下降.推测，液料比的增加，会令更多竞争性杂质溶出，降低总黄酮提取率.且较大的液料比，会为后面的浓缩带来困难.因此，分别择优选择15∶1、20∶1、25∶1 的液料比作为响应面法的三个因素水平.

2.3.2 煎煮时间对综合评分的影响

按照“表1”中动态条件试验，并计算出试验结果的综合评分，绘制煎煮时间对综合评分曲线图，见图1(B).复方五花提取液综合评分随着时间的增大而提高，当煎煮时间为1 h时，综合评分最高，之后开始下降.推测，本实验使用煎煮法提取，并且花类药材易挥发，药液中的总黄酮随着煎煮时间增加，会逐渐分解.综合考虑，煎煮时间分别选择0.5、1、1.5 h作为响应面法的三个因素水平.

2.3.3 提取次数对综合评分的影响

按照“表1”中动态条件试验，并计算出试验结果的综合评分，绘制提取次数对综合评分曲线图，见图1(C).煎煮次数在2次时，综合评分提高较快，之后随提取次数增加综合评分差别不大.所以综合考虑节约资源，分选择1、2、3次作为响应面法的三个因素水平.

2.4 响应面法优化提取工艺

2.4.1 响应曲面优选分析

据单因素实验结果，选择液料比、煎煮时间、煎煮次数三个因素，每个因素三水平(见表2)，以总黄酮提取率和干浸膏得率的综合评分为为响应值，使用Design-Expert8.05b软件设计Box-Behnken响应面，并进行相关的数据分析设计.

由表3的数据可知，回归模型P＜0.0001，说明此模型极其具有显著性.且R2=0.9862，表示实验所得值与预测值有较好的拟合度，失拟项P＞0.05不具有显著性，说明方程模拟较好，采用此方法进行复方五花颗粒的提取工艺的预测和分析具有可行性.所得出的二次多元回归方程：

Y=96.08-1.48A-4.29B+1.25C+1.05AB-1.25AC-1.54BC-3.45A2-12.78B2-4.75C2.

从回归方程显著性表明：一次项回归方程中，A、B、C都具有极其显著性，对综合评分影响较大.在交互项中，BC具有显著性，其他两个交互项无显著性.在二次项中，A2、B2、C2都具有极强的显著性.综上所述，3个因素水平中对复方五花颗粒提取工艺影响结果依次为：B＞C＞A.结果见表3～表4.

图1 各提取因素对综合评分结果的影响Fig.1 Influence of extraction factors on the comprehensive rating results

表2 实验因素和水平Table 2 Experimental factors and levels

表3 提取工艺响应面实验设计与结果Table 3 Experimental design and result of response surface of extraction process

(续表3)

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.4.2 响应面图谱与分析

根据数据和模型，绘制响应曲面图，见图2.从图2可以直观的看出3因素和两两因素交互作用对响应值的影响.提取时间的曲面陡峭，说明提取时间对提取工艺影响较显著.液料比较平缓，说明液料比对提取工艺影响不如提取时间大；提取次数和液料比的曲面陡峭，说明提取次数和液料比对提取工艺影响较显著；提取次数和提取时间的曲面陡峭，说明提取次数和提取时间对提取工艺影响较显著.

根据单因素实验和二次回归模型的综合分析，采用Design-Expert8.05b软件计算，优化过后的最佳提取工艺条件为：液料比18.60∶1，提取时间0.90 h，提取次数2.20次，在此条件下，综合评分最大值为96.8234.同时，考虑操作的方便，将五花提取工艺参数的最优项调整为：液料比20∶1，提取时间0.9 h，提 取2次.

图2 因素交互作用对综合评分影响的响应曲面图Fig.2 Dependent variable relative to the effect of the variable surface three-dimensional chart

2.5 验证实验的结果分析

2.5.1 验证实验

对最佳提取条件进行验证，从而进一步考察响应面法的可靠性.分别依照比例称取药材3份，每份共10 kg，按照所选的最佳提取工艺∶液料比20∶1，提取时间0.9 h，提取2次，进行验证试验，测定总黄酮提取率和干浸膏得率.验证实验数据表明，每个批次的干膏得率和总黄酮得率都接近响应面法最优数据的理论值，因此采用响应面法优选的无糖型复方五花颗粒的提取工艺切实可行，结果见表5.

表5 验证试验(n=3)Table 5 Verification tests(n=3)

3 讨论

提取工艺优化，通常采用均匀试验和正交实验等常用的方法，这些方法虽然避免了大量重复性的实验，但客观存在着精密性差，适用范围有限等缺陷.而响应面法采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，是把各因素与响应值之间的关系用函数来表示，将数据系统分析，以有限点估面，软件自动生成连续变量的曲面模型，优选出最佳组合因素[12-13].该方法试验次数少、试验周期短，求得的回归方程精度高且能够研究几种因素间的交互作用.因此，响应面法比传统优化方法能更直观、准确得到最优组合.

本实验过程由于处方药材中富含黄酮类成分，高温不稳定，为了避免有效成分被破坏，通过预实验摸索，提取过程控制温度在80～85℃，并选择减压浓缩、干燥，控温在80℃左右.