牛骨胶原低聚肽对术后小鼠伤口愈合作用初步探讨

徐 腾，李 迪，李 林，王天星，刘欣然，李 勇

(北京大学公共卫生学院营养与食品卫生学系，北京 100191)

机体的营养状况是影响伤口愈合的重要因素之一[1-4]。外科手术后病人很容易陷入营养不良状态，导致伤口愈合延迟[5]。因此，通过提供合理的临床营养支持，达到预防和减轻营养不良、增强机体免疫力，进而促进术后伤口愈合至关重要。

牛骨胶原低聚肽(BCOPs，以下简称牛骨肽)提取自牛骨，是一种动物性生物活性肽。研究发现，低聚肽比单个氨基酸的吸收更有效，且能直接参与蛋白质的合成，提高机体对蛋白质的利用率[6]，具有促消化吸收、降胆固醇、增强免疫、降血压、降血糖、抗肥胖、抗氧化、缓解疲劳等生理功能[7-8]。本研究采用牛骨肽作为干预物，通过建立模拟临床的皮肤切口手术模型，探讨BCOPs作为营养制剂在伤口愈合中发挥的作用，为寻找促进伤口愈合功能性保健食品及药品的开发提供实验研究基础。

1 材料与方法

1.1 样品

BCOPs，淡白色固体粉末，由北京天肽生物科技有限公司提供。经凯氏定氮仪测定器肽含量为92.77g/100g，酸溶蛋白含量为95.5g/100g。进一步经高效液相色谱仪分析其中游离氨基酸组成，可知氨基酸总量占2.73%，其中精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸较多。

1.2 主要试剂及仪器

4%水合氯醛、6mm打孔器、Adventurer TM 通用型分析天平，美国奥豪斯国际贸易有限公司；Eppendorf 高速冷冻离心机，德国艾本德股份公司；电热恒温水浴锅，北京天林恒泰科技有限公司；正置荧光显微镜，NIKON E400。

1.3 实验动物

雄性ICR小鼠180只，体重18～22g，购于北京大学医学部实验动物中心。自由饮食、饮水。饲养实验室符合国标清洁级，温度范围25±1℃，相对湿度50%～60%，室内照明控制在12h/12h光暗周期节律。

1.4 实验分组与处理

1.4.1实验分组 经适应期喂养后，将180只小鼠随机分为6组，设1个空白对照组和5个BCOPs剂量组(0.375、0.75、1.5、3.0、6.0g/kg·BW)，分别对应BCOPs(0.375)、BCOPs(0.75)、BCOPs(1.5)、BCOPs(3.0)、BCOPs(6.0)，每组小鼠随机分为3个亚组，每个亚组10只。

1.4.2皮肤切口手术模型建立 小鼠经4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，采用剃毛刀将背部毛发去除，使用碘伏与酒精消毒后，在距背部中线1cm的两侧分别切一个 1.5cm长的纵行切口，同时切开肌肉，深达腹腔，然后逐层缝合肌肉和皮肤，术后涂 2%碘酊，注射青霉素 G(1 000IU/g·BW)以防止感染，术后禁食6h，正常饮水。

1.4.3牛骨胶原低聚肽干预 将手术当天记为术后第0天(POD0)，术后6h进行受试物干预，每日经口灌胃给予受试样品。空白对照组给予蒸馏水，BCOPs剂量组给予相应浓度受试物，灌胃量为1mL/100g，受试样品给予时间为11d。实验期间观察实验动物的一般情况，包括毛色、精神状态、日常活动情况等。

1.5 皮肤切口抗张力强度检测

术后第7、11天，沿切口垂直方向切取以切口为中线，宽为0.5cm、长为中线双侧各0.5cm并包含切口在内的皮肤组织，去除皮下脂肪组织，于长方形短边以丝线缝合作为牵引线，将皮条放置在带有张力感受器的装置中间，张力感受器另一端链接于多功能生物信号采集系统，采用带有游标卡尺的微调装置手动逐渐拉伸皮条，记录皮条被拉断时的张力。测微尺测量皮肤的厚度，每平方毫米面积的张力即为切口的抗张力强度。

1.6 血清指标检测

在术后第3、7、11天经内眦采血分批处死小鼠，留取血清。采用ELISA法测定血清PA、IL-10、TNF-α含量。

1.7 病理观察

各组小鼠分别于术后3、7、11天于伤口处距切口边缘0.3cm处取全层皮肤组织，用4%甲醛进行固定，保存后待做石蜡切片及HE染色。

1.8 统计方法

数据均以平均值±标准差表示。采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，差异显著者进行方差齐性检验，方差齐者以LSD法对多组均数进行post-hoc分析，方差不齐者以Dunnett’s T3法对多组均数进行post-hoc分析。以P<0.05为差异显著性标准。

2 结果与分析

2.1 小鼠一般状况

实验期间各组小鼠无死亡，饮食、饮水正常，生长、活动未见异常，毛色、精神状况未见异常；实验期间小鼠体重在术后下降，随后正常增长，与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。

2.2 牛骨肽对皮肤切口抗张力强度的影响

在POD7，BCOPs(0.375、0.75、1.5)剂量组抗张力强度高于对照组，但是结果无统计学差异(P>0.05)；POD11，牛骨肽各剂量组小鼠抗张力强度均高于对照组，其中BCOPs(1.5)剂量组与对照组相比，抗张力强度结果具有统计学差异(P<0.05)(表1)。

2.3 牛骨肽对小鼠血清PA、IL-10、TNF-α含量的影响

POD3，除了BCOPs(6.0)剂量组小鼠血清PA浓度明显低于对照组外(P<0.05)，其余各剂量组小鼠血清PA浓度均明显高于对照组(P<0.05)；POD7，BCOPs(0.375、1.5、6.0)剂量组小鼠血清PA浓度明显低于对照组(P<0.05)；POD11，BCOPs(3.0)剂量组小鼠血清PA浓度明显高于对照组；其余各剂量组则明显低于对照组(P<0.05)(表2)。

组别抗张力强度(g/mm2)POD7POD11空白对照组22.51±1.7334.05±4.77BCOPs(0.375)27.58±3.9836.98±4.21BCOPs(0.75)25.69±6.5337.99±4.39BCOPs(1.5)23.46±3.5940.16±6.07aBCOPs(3.0)22.82±1.2937.58±3.02BCOPs(6.0)25.56±4.2436.20±2.40

注：a与对照组相比结果有明显差异，P<0.05

组别血清PA浓度(μg/mL)POD3POD7POD11空白对照组31.62±2.7540.71±4.2139.98±3.32BCOPs(0.375)45.93±2.08a25.97±3.16a25.36±3.54aBCOPs(0.75)47.29±3.34a41.01±3.2620.61±3.87aBCOPs(1.5)39.71±3.17a35.17±4.04a28.67±4.09aBCOPs(3.0)36.68±3.13a42.13±4.2947.84±3.89aBCOPs(6.0)23.86±3.75a28.83±3.76a26.96±3.81a

注：a与对照组相比结果有明显差异，P<0.05

POD3，BCOPs(0.375、0.75)剂量组小鼠血清IL-10浓度明显大于对照组(P<0.05)；POD7，BCOPs(0.375、0.75、1.5)剂量组小鼠血清IL-10浓度明显大于对照组(P<0.05)；POD11，BCOPs(0.75、1.5、3.0、6.0)剂量组小鼠血清浓度明显大于对照组(P<0.05)(表3)。

组别血清IL-10浓度(pg/mL)POD3POD7POD11空白对照组508.07±70.39533.71±86.23499.31±75.09BCOPs(0.375)901.18±101.05a633.29±82.11a498.37±66.53BCOPs(0.75)825.55±114.94a710.37±56.71a569.32±73.90aBCOPs(1.5)899.85±94.80632.43±85.35a743.78±73.26aBCOPs(3.0)625.79±62.26454.28±77.67700.89±94.40aBCOPs(6.0)512.92±49.37595.06±74.14590.23±47.65a

注：a与对照组相比结果有明显差异，P<0.05

POD3，BCOPs(6.0)剂量组小鼠血清TNF-α浓度明显低于对照组(P<0.05)；POD7，BCOPs(0.375、0.75、1.5、6.0)剂量组小鼠血清TNF-α浓度均明显低于对照组(P<0.05)；POD11，BCOPs(0.375、0.75、3.0、6.0)剂量组小鼠血清TNF-α浓度均明显低于对照组(P<0.05)(表4)。

组别血清TNF-α浓度(ng/L)POD3POD7POD11空白对照组498.29±46.91625.99±69.02611.05±65.08BCOPs(0.375)400.54±97.34515.31±84.31a501.99±56.12aBCOPs(0.75)503.99±41.71456.88±59.89a365.92±58.41aBCOPs(1.5)461.23±79.06518.22±64.51a570.31±52.09BCOPs(3.0)590.36±71.59594.22±97.76318.58±64.29aBCOPs(6.0)345.54±23.87a377.74±53.47a535.95±54.18a

注：a与对照组相比结果有明显差异，P<0.05

2.4 组织病理学观察

图1～3分别为皮肤切口手术模型小鼠在术后3、7、11d时的HE染色结果。POD3，镜下可见对照组表皮连接，真皮层断裂，依稀可见炎性细胞；各剂量组表皮连接，且表皮层厚度较对照组高，伤口处可见炎性细胞浸润，BCOPs(0.375、1.5、3.0)剂量组可见真皮层连接。POD7，对照组表皮层增厚，真皮层断裂，而各剂量组真皮层均已连接，BCOPs(0.375、0.75)剂量组可见炎性细胞浸润，BCOPs(1.5、3.0、6.0)剂量组可见纤维母细胞分化增生，胶原排列不整齐；BCOPs(3.0、6.0)镜下可见血管增生；POD11，对照组表皮层与真皮层均已连接，镜下可见纤维母细胞和毛细血管，BCOPs(0.375、0.75)剂量组可见毛囊等附属器官，胶原、排列趋于整齐，BCOPs(1.5、3.0、6.0)剂量组愈合良好，伤口处与正常组织相差不大。

3 讨论

正常的伤口愈合包括3个时期，即炎症期、增生期和修复期[9-11]。本实验以蒸馏水组作为空白对照，采用皮肤切口手术模型，模拟临床Ⅰ期愈合方式，观察牛骨肽对小鼠术后伤口愈合的促进作用。抗张力强度可以反映新生成的皮下胶原纤维在分子层面上的连接能力，是衡量伤口愈合状况的一个重要指标[12]。本实验选择在伤口愈合的第7天和第11天测量小鼠术后伤口愈合的抗张力强度，是因为此时基本处于伤口愈合的增生期和瘢痕期，在此时期，包括纤维母细胞分化、血管生成、胶原纤维形成等一系列变化，伤口具有一定的张力。从实验结果来看，术后第7天，各剂量组抗张力强度与对照组之间无明显差异，但是其均值均大于对照组；术后第11天，BCOPs(1.5)剂量组小鼠皮肤抗张力强度明显大于对照组，提示了皮肤愈合良好，此剂量组对于伤口愈合具有明显的促进作用。其他剂量组与对照组相比虽然无明显差异，但是均值均大于对照组，显现出伤口愈合良好的趋势。

术后对于机体进行必要的营养支持，有利于机体的快速恢复[13]。血清PA具有半衰期短、代谢迅速、特异性和敏感性强的特点，其血清中的浓度与营养状况的早期变化密切相关，可反映人体脏器蛋白质含量状况，是评价和监测患者营养状态的金标准[14-15]。术后第3天，BCOPs(0.375)、BCOPs(0.75)、BCOPs(1.5)、BCOPs(3.0)剂量组小鼠血清PA浓度明显高于对照组，提示此时机体营养状况良好，此剂量牛骨肽可通过促进PA的表达使小鼠保持良好的营养状态；同时多个剂量组血清ALB浓度明显高于对照组，进一步证明牛骨肽对于术后小鼠的蛋白营养作用。由于PA属于急性时相反应蛋白，半衰期较短，因此，随着术后时间的推进其浓度降低。而其在术后第7天和第11天浓度明显低于对照组的情况，推测可能的原因是由于伤口愈合进程加快，导致组织修复消耗了大量的能量。

图1 皮肤切口手术模型小鼠皮肤组织POD3组织形态(HE染色，200×)

图2 皮肤切口手术模型小鼠皮肤组织POD7组织形态(HE染色，200×)

图3 皮肤切口手术模型小鼠皮肤组织POD11组织形态(HE染色，200×)

白介素10(IL-10)是一种抗炎性细胞因子。 IL-10可以不依赖于其对抗原呈递细胞的抑制而直接作用于T细胞。在中性粒细胞中，IL-10能抑制炎症介质的产生，从而抑制由脂多糖和吞噬细菌引起的肿瘤坏死因子 TNF-α及 IL-1β的产生[16]。此外，IL-10能抑制各种趋化中性粒细胞化学因子释放，也能够抑制环氧合酶-2和前列腺素E2的合成。在嗜酸性粒细胞中，IL-10能抑制脂多糖引起的各种炎性介质(如 TNF-α等)的产生，进而避免了炎症反应的发生[17]。本实验中，除了术后第7天时BCOPs(3.0)剂量组IL-10浓度小于空白对照组外，其余时期牛骨肽剂量组IL-10浓度均大于对照组，提示牛骨肽通过促进IL-10的表达抑制炎症反应。

肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在创伤愈合中的主要作用是炎性细胞渗透[18]，并且TNF-α具有双重生物学效应，浓度较低时主要作为白细胞和内皮细胞的自分泌及旁分泌的调节物质，可以抵抗细菌、病毒和寄生虫的感染，促进组织修复，调节炎症反应，引起肿瘤细胞凋亡等；高浓度时，过量的TNF-α则会破坏机体的免疫平衡，与其他炎症因子一起产生多种病理损伤[19-20]。POD3，BCOPs(6.0)剂量组小鼠血清TNF-α浓度明显低于对照组(P<0.05)；POD7，BCOPs(0.375、0.75、1.5、6.0)剂量组小鼠血清TNF-α浓度均明显低于对照组(P<0.05)；POD11，BCOPs(0.375、0.75、3.0、6.0)剂量组小鼠血清TNF-α浓度均明显低于对照组(P<0.05)，提示牛骨肽可通过下调TNF-α的表达促进组织修复，其具体的通路可能与IL-10的表达增加有关。

除以上证据外，病理观察结果也同样提示牛骨肽剂量组伤口愈合情况优于空白对照组。因此，笔者认为牛骨肽可在术后早期提供充分的营养支持，并且其可抑制IL-10和TNF-α的表达以促进伤口愈合。

4 结论

本研究通过建立小鼠伤口模型，探讨BCOPs对于伤口愈合是否具有促进作用。结果表明，牛骨肽可以有效促进小鼠伤口愈合，这一方面是因为牛骨肽可通过术后早期营养支持使机体具有充足的组织修复的能量，另一方面与牛骨肽抑制炎症因子的表达有关。由于伤口愈合是一个复杂的过程，BCOPs对于促进伤口愈合的具体机制仍有待进一步研究。◇