猪冷冻精液生产关键技术的研究

黄启震，周 米，常 迪，李 燕，冯 妍，郭 勇，倪和民，周学军，丁 进，王相国*

（1.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206；2.河北省三河市盛繁商贸有限公司，河北 三河 065200；3.北京熊特牧业有限公司，北京 100101）

0 前言

从19世纪60年代国际上就开始对猪冻精进行了研究，起初解冻后精子活力仅仅能达到30%，直至20世纪初，英国Polge家族将精子活力提升至60%，但仍然达不到生产要求，不能应用于商品猪生产。我国从1970年开始进行液氮冷冻精液技术的研究和推广，1990年以后冷冻精液逐步从颗粒型转变为细管型。由于猪精子特殊的生物学特性，猪精子程序化冷冻和解冻过程中容易受到损伤，与常温保存精液效果相比仍有很大差距。猪冷冻精液配种后，分娩率仅为40%～70%，较常温保存精液低20%～30%；窝产仔数为7～10头，较常温精液少2～3头，猪冻精繁殖效果一直不理想，尚未发挥积极作用。

国外很多研究报道，在稀释液中添加糖类、抗氧化物质、蛋白质等对猪冷冻精液品质具有一定的提高作用[1-2]。 国内主要集中在冷冻方法和甘油作为冷冻保护剂方面的研究。周佳勃等[3]、李青旺等[4]和索永善等[5]均对冷冻程序、冷冻方法和甘油等抗冻剂的不同添加量对猪精子活力的影响进行了研究，其最终目的都是为了能建立起一套完善的猪精液冷冻体系。试验对平衡液、冷冻液、稀释液进行了优化，分别加入了X、Y、Z成分，最大程度上减少冷冻、解冻对精子的损伤。同时对解冻温度和解冻时间进行了优化，系统研究了精子密度、精液的用量以及输精部位对受胎率的影响。试验成功研制出的猪冷冻精液生产技术是养猪业历史上一次颠覆性、革命性的变革，它大大提升了公猪的选种强度，使得顶级基因的应用真正实现跨区域、跨国界的运营。

1 方法

1.1 对猪精液的冷冻组合液进行优化

降温平衡液（SF-1)：葡萄糖、乳糖、青霉素、链霉素、蛋黄、X成分；

冷冻液（SF-2）：葡萄糖、柠檬酸钠、氯化钠、青霉素、甘油、椰油单乙醇酰胺、十二烷基硫酸钠、三乙醇胺、盐酸、蒸馏水、Y成分；

稀释液（SF-3)：无水柠檬酸、咖啡因、三羟甲基氨基甲烷、碳酸氢钠、乙二胺四乙酸二钠、丙酮酸钠、葡萄糖、Z成分；

注：试验新研发的X、Y、Z成分为保密配方成分，专利所有权归三河盛繁公司所有。

1.2 冷冻、解冻方法

鲜精离心，弃去上清液，加入SF-1液降温平衡至2℃进行离心，弃去上清液后，加入适量SF-2液立即灌装冷冻，冷冻方法是液氮熏蒸冷冻或程序冷冻仪冷冻。解冻方法是用50℃的水16 s解冻至Sf-3液进行稀释配种。

1.3 指标测定

1）在不同的解冻温度和解冻时间条件下解冻，检测各时间、温度对精液品质的影响；

2）检测使用SF-1对猪精液降温平衡效果的影响，包括检测精子活力、畸形率；

3）选用不同的精子密度，进行冷冻处理、解冻，通过对解冻后精液质量的判断，确定最佳冷冻精子密度（冻前精子活力约为0.84）；

4）在已加入常用降温液的精液中（1，2，3，4），再分别加入含3%甘油的（1，2，3，4），常用降温液即为传统冷冻液（5，6，7，8），对已加入SF-1液的精液进行离心去上清液，然后加入适量SF-2液与传统冷冻液（5，6，7，8）同时进行冷冻，通过测定解冻后精子质量，比较各冷冻液之间保护效果；

5）精液解冻后，需要加入一定的稀释液后方可进行输精，试验应用相同的冷冻精液，在解冻后加入不同的稀释液，比较常规稀释液与SF-3液对冻后精液的影响；

6）选用法系长白，输精两次，采用不同的精子量进行配种，检测受胎率以及平均窝产仔数；

7）确定输精部位，分别在母猪子宫体和子宫角进行输精；

8） 输 精 剂 量 为 20 ml、25 ml、30 ml、35 ml、40 ml、45 ml时， 检 测受胎率和平均窝产仔数。

1.4 注意事项

1.4.1 解冻条件

1）解冻室室温为30℃以上；

2）用专用温度计测定恒温水浴锅，温度计与视线持平观察，且温度计处于水位中间位置不可触碰锅底。温度计以百钧达温度计为准校正解冻流程中所用的其他温度计。水浴锅内的水位高为5 cm；

3）冻精取出暴露在空气中时间不可超过3 s，应迅速放入水中解冻。确保冻精放入水中，不起霜，不粘连，不漂浮；

4）1ml精液解冻时保证水浴锅总水量控制在2/3以上，在水浴锅解冻过程中精液会有下沉情况，不要让精液沉到水浴锅铁板上，可在水浴锅底部放置两支温度计起到支撑作用，或用手捏住细管封口端，同时保证含有精液的部分放置在水面以下进行解冻；

5）精液细管在解冻时，眼观无明显裂口破损现象，解冻过程中出现空气端进水，解冻后请不要晃动精液细管，避免水分与精液混合，应立即用剪刀剪掉进水部分，保证含有水分的部分不能对稀释液进行稀释，即不会影响产品质量；

6）取精液，放水中，按秒表需一气呵成。

1.4.2 精液稀释条件

1）将冷冻的稀释液提前40 min放在36℃恒温水浴锅内预温。精液需稀释到相应品种的稀释液中，保证稀释液液面与水位面等高；

2）将解冻后精液细管表面的水分擦干，在36℃稀释液内稀释摇匀。摇匀精液时，精液不可露出水面，且用力轻柔，不可剧烈摇晃，以免过多起沫。

1.4.3 精液镜检要求

在室温30℃以上的条件下，取20ul稀释并摇匀后的精液放在38℃恒温板上的已恒温的载玻片上，盖上已恒温的盖玻片镜检。稀释后的精液需在平均3～10 min内镜检，镜检工作要迅速，避免细小环节造成的精子温差休克；大白、长白精液解冻后可直接取样放在显微镜下，缓3～5 min即可检测活力；杜洛克精液解冻后在水浴锅内复苏8～10 min，再取样放在已恒温的载玻片上缓1～2 min即可检测活力（检测活力：需显微镜调为白色柔光，显示屏右下角放大倍数为0，微微转动显微镜粗细调，将载玻片最上面一层精子调至最清晰，目测活力）。

2 结果

2.1 降温平衡液对猪精液的影响

在相同条件下，SF-1液与BTSS、Schonow、萄-柠-EDTA、ZO等四种降温平衡液相比，精子活力达到0.78，差异显著（P＜0.05）。在精子畸形率方面，SF-1组显著低于其他四组，差异显著（P＜0.05），见表1。

2.2 SF-2液与传统冷冻液对冷冻效果的影响

SF-2液与编号为5，6，7，8的冷冻稀释液相比，精子活力、质膜完整率以及顶体完整率显著高于对照组，而畸形率降低到22%左右（P＜0.05），差异显著，见表2。

2.3 SF-3液与常规稀释液对受胎率的影响

相同条件下，研究常规稀释液与SF-3对精子的影响，由表3可知，经过SF-3稀释液处理后精子活力达到0.74，与常规稀释液相比提高了9个百分点。在受胎率方面达到90%，显著高于常规稀释液。

表1 降温平衡液对猪精液的影响

表2 SF-2液与传统冷冻液对冷冻效果的影响

表3 SF-3液与常规稀释液受胎率的影响

2.4 解冻的温度和时间对精液品质的影响

解冻的温度与时间对精液品质有着至关重要的作用，试验对0.5 ml的种猪冷冻精液进行了研究，发现在50℃条件下解冻16 s对精子活力、质膜完整率、顶体完整率影响最小，精子畸形率也保持在20.2%左右的水平，见表4。

表4 解冻的温度和时间对精液品质的影响

2.5 精子密度对猪精液冷冻效果的影响

对不同精子密度的猪精液进行冷冻、解冻，然后检测精液质量，由表5可知，精子密度在4×109/mL时，精子活力、质膜完整率、顶体完整率均显著高于其他组，畸形率显著低于其他组。当精子密度越来越高时，精子质量越差。

表5 精子密度对猪精液冷冻效果的影响

2.6 冷冻精液配种最适精子量

品种均选择法系长白，对母猪进行两次输精，统计受胎率和产仔数。输精在4亿精子以下时受胎率最高只能达到31%，产仔数仅为7头。当输精精子数升高至8亿到12亿之间时受胎率能达到90%以上，平均窝产仔数也在11头以上。随着输精精子数的升高，受胎率和平均窝产仔数略有下降，见表6。

表6 冷冻精液配种最适精子量

2.7 鲜精与冷冻精液子宫体与子宫角输精效果比较

在一次输精40 mL、8亿精子数的条件下，鲜精在子宫角或子宫体输精在受胎率和窝产仔数上没有显著差异，但冷冻精液子宫体输精的受胎率显著高于在子宫角，见表7。

3 讨论

冷休克是指精子在迅速冷却时会失去活力，一般发生在精液采集后迅速至15℃、5℃或0℃时[6]。徐振军等[7]以葡萄糖、乳糖作为基础液发现精子存活率极显著高于蔗糖和乳糖组，顶体完整率显著高于其他组。金一等[8]研究表明海藻糖能抑制精子内活性氧的发生。胡建宏等[9]发现添加25%的海藻糖可以明显抑制精子获能，当与甘油共同作用时能更加有效地保护精子。还有研究表明，在稀释液中添加10mg/L维生素C、0.05%可溶性N-乙酰基-D-葡糖胺、类透明质酸、安钠咖、海胆色素、2-丙羟基-β-环式糊精等可提高精子顶体完整率和质膜完整性，保护精子活力。冰晶的形成会造成精子不可逆的伤害[10]。在冷冻保存过程中，冷冻保护剂非常重要。保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受损伤[11]。甘油是目前应用较广泛的一种冷冻保护剂，很多研究显示在添加2%～4%时，其解冻后精子活力和顶体完整率较高[12]。试验使用的降温平衡液SF-1对猪精液的降温平衡效果有着显著促进作用，其中含有葡萄糖、乳糖、青霉素、链霉素、蛋黄、X成分；冷冻液（SF-2）含有葡萄糖、柠檬酸钠、氯化钠、青霉素、甘油、椰油单乙醇酰胺、十二烷基硫酸钠、三乙醇胺、盐酸、蒸馏水、Y成分；稀释液（SF-3)含有无水柠檬酸、咖啡因、三羟甲基氨基甲烷、碳酸氢钠、乙二胺四乙酸二钠、丙酮酸钠、葡萄糖、Z成分；在这些成分中，试验添加的X、Y、Z成分对精子活力、质膜完整率、顶体完整率、受胎率相比其他配方均起到了更明显的促进效果，降低了精子畸形率。

表7 鲜精与冷冻精液子宫体与子宫角输精比较

解冻的温度和时间在冷冻精液中也尤为重要。Watson[13]发现精液解冻温度与精子对“冷冻-解冻”温度骤变的敏感性有关。郑筱峰等[14]的研究表明，37℃水浴30 s解冻法与室温20 s后于37℃水浴10 s解冻法相比对精子的损害程度更低。试验研究表明， 0.5 mL的种猪冷冻精液，在16 s解冻条件下，使用50℃的解冻温度效果最好。

精子密度对精子的活力有较大影响，生产中要控制精子密度。输精量可在有限范围内波动，但过多的输精量会增加成本，所以每次输精精子数控制在8亿～12亿之间最佳。夏天等[15-16]研究表明，采用深部输精技术可以使精液快速、大量地进入母猪子宫角，提高窝均产活仔数1.36头。使用鲜精和冷冻精液分别进行试验，研究发现鲜精在子宫角或子宫体输精差异不显著；但当使用冷冻精液时，在子宫体的受胎率和窝产仔数显著提高。虽然输精时采取了各种预防消毒措施，子宫角输精还是容易造成子宫感染，导致母猪不孕，曾有报道子宫角输精时导致的子宫炎症高达20%。因此，输精时选用子宫体输精最佳。

4 结论

试验通过新研发的猪精液稀释液配方，猪精液冷冻、解冻程序，大幅度提高了冷冻精液的活力，降低了畸形率。确定了最适精子密度、单次输精量以及最佳输精部位，有效地增加了受胎率和平均窝产仔数，放大了顶级基因的遗传效益，降低了公猪引种和饲养成本，杜绝了多种疫病的垂直传播，为加快育种进程提供了坚实的技术支持。