金钗石斛多糖的分离纯化及其抗衰老活性研究△

谢苗苗，肖柳，杨磊，杨全伟

(1.武汉市中医医院，湖北 武汉 430000；2.湖南中医药大学附属第一医院，湖南 长沙 410000；3.武汉市第一医院，湖北 武汉 430000)

金钗石斛是宝贵的食药两用药物，化学成分主要有多糖类、生物碱类和酚类等[1-2]，其中多糖为主要成分之一[3-5]。现代科学研究表明，金钗石斛多糖具有调节免疫、抗疲劳、抗炎和抗氧化等功能[6-7]，引起了众多专家学者的关注。文中通过研究金钗石斛多糖的分离纯化工艺及抗衰老生物活性，在H2O2诱导的细胞损伤中，氧化应激是重要损伤机制。肝细胞受损后产生的过量活性氧自由基，攻击生物膜，引发脂质过氧化，使过氧化物水平增高，引起细胞中毒，导致细胞死亡[8-9]。利用H2O2诱导HepG2细胞损伤，研究多糖的抗衰老作用，为金钗石斛多糖的开发应用提供参考[10]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

药材与试剂：金钗石斛Dendrobiumnobile购自北京同仁堂有限公司，葡萄糖标准品(中国食品药品检定研究院，批号：110833-201502)，葡聚糖Dextran T-(末端-)2 000、T-700、T-580、T-500、T-80、T-70、T-40、T-11、T-9.3 和 T-4(瑞典 Pharmacia 公司)，二乙氨乙基纤维素(DEAE-Cellulose)，透析袋(分子截留为相对分子质量3500，上海绿鸟公司)，MTT(Sigma公司)；DMEM培养基(HyClone，Thermo scientific，USA)；马血清；新生小牛血清；PBS，CAPE，30%过氧化氢均等试剂购自国药试剂有限公司，均为分析纯。

仪器与设备：B5-1磁力搅拌器、BSZ-100 自动部分收集器和 HL-2 恒流泵(上海青浦沪西仪器厂)，Beckman高速离心机(美国Beckman公司)；752N 紫外可见分光光度计(上海精科仪器有限公司)，CO2细胞培养箱(美国Thermo 公司)；倒置显微镜(美国Thermo 公司)；分析天平(上海精科仪器有限公司)；全波长酶标仪(美国Thermo 公司)。Agilent 1260 Series 高效液相系统，SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司)，RE-201D恒温水浴锅(上海普渡生化科技有限公司)，电热鼓风干燥箱(上海智城分析仪器制造有限公司)。

2 方法

2.1 金钗石斛多糖的制备

金钗石斛药材取500 g，加入10倍体积95%乙醇脱脂，干燥后用15倍体积水回流提取，提取3次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩至适量体积后，离心，上清液用流动水透析2 d，除去色素和无机盐等。然后将透析袋内液浓缩至约1 L，离心后取上清液用3倍体积95%乙醇于4 ℃下进行冷冻沉淀，静置24 h，离心。沉淀物用无水乙醇洗涤3次后，于60 ℃真空干燥器中干燥，得到金钗石斛水提粗多糖。

2.2 DEAE-52纤维素柱纯化

2.2.1 多糖纯化 将所得多糖溶于蒸馏水中，制成浓度为20 mg·mL-1的溶液，利用DEAE-52纤维素阴离子交换柱(50 cm×5 cm)进行分离，硫酸-苯酚法490 nm处进行紫外检测，合并洗脱液，浓缩至小体积后对去离子水透析，冷冻干燥后得到纯化金钗石斛多糖DNPL。

2.2.2 多糖纯度检查 取适量经过DEAE纤维素柱分离纯化的多糖， 配成1 mg·mL-1的多糖溶液， HPGPC上样，色谱柱为Sephadex G-100凝胶柱，记录出峰的色谱曲线。观察曲线是否为形态对称， 单一峰形。

2.2.3 金钗石斛多糖的中性糖含量测定 称取200 mg烘至恒重的葡萄糖，蒸馏水定容至 100 mL为母液，吸取10 mL母液定容至100 mL为工作液，摇匀，准确吸取工作液0、0.2、0.4、0.6、 0.8、1.0 mL于10 mL具塞试管，用水定容至1 mL，加入苯酚溶液0.4 mL，摇匀后再浓硫酸5 mL，摇勾，冰浴冷却至常温后，沸水浴煮沸10 min后，冷至室温，在490 nm波长下检测吸光度。再精密称取金钗石斛多糖50 mg，用蒸馏水溶解，于50 mL容量瓶中定容，按标准曲线制作方法，取1mL样液于10 mL具塞试管中，加入苯酚溶液0.4 mL，摇匀后再浓硫酸5 mL，摇勾，冰浴冷却至室温后，沸水浴煮沸10 min，再冷却至室温，在490 nm波长下检测吸光度。根据标准曲线计算出金钗石斛多糖的中性糖含量。

2.2.4 金钗石斛多糖的相对分子质量测定 采用HPGPC法测定金钗石斛多糖的分子量。分别精密称取标准葡聚糖Dextran T-(末端-)2000、T-700、T-580、T-500、T-80、T-70、T-40、T-11、T-9.3和 T-4各5 mg，用1 mL的蒸馏水溶解后，离心，上样，色谱柱为Sephadex G-100凝胶柱，流动相为0.1 mol·L-1NaNO3，流速为1.0 mL·min-1；检测器为示差折光检测器，柱温40 ℃。另取多糖样品5 mg，加蒸馏水1 mL(浓度为5 mg·mL-1)、离心、取上清液，按上述洗脱条件进行分离，测定洗脱体积，根据标准曲线求出多糖组分的相对分子质量。

2.3 多糖的配置

钗石斛多糖用PBS缓冲液配置成10 mg·mL-1的储存液，后用完全培养基稀释的工作浓度进行细胞处理。

2.4 HepG2细胞培养和处理

HepG2细胞株由ATCC所提供，保存于液氮中，用含10%胎牛清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL链霉素的RPMI1640培养基培养。置于37 ℃饱和湿度、含5%CO2和95%空气的恒温箱中培养，直接吹打无需胰蛋白酶消化传代，待细胞传至10～20代时进行试验[6]。

2.5 MTT法检测细胞存活力

HepG2细胞1×104cells/mL的细胞悬液，以每孔50 μL接种于96孔培养板。培养过夜细胞贴壁后，加入样品继续培养24 h(浓度分别为1000、500、250、125、62.5、31.25、0 μg·mL-1)，加入含终浓度为5 mg·mL-1的MTT的新鲜培养基培养4 h，每孔加入100 μL 裂解液，待结晶完全溶解后，酶标仪上570 nm波长处测定吸光度值。计算细胞生长存活率[11-13]。

2.6 H2O2诱导肝癌HepG2细胞损伤模型的建立

HepG2细胞以1.5×104细胞/孔的密度接种于96孔板内，贴壁24 h后给予多糖处理，浓度分别为1000、500、250、125、62.5、31.25、0 μg·mL-1，给药2 h后给予800 uM过氧化氢处理，处理期间全程给药，空白对照组比较。设置阳性参照物为CAPE 。

过氧化氢处理2 h后，每孔加入MTT后使其终浓度为0.5 mg·mL-1，37 ℃孵育4 h 后，每孔加入100 μL裂解液，待结晶完全溶解后，酶标仪上570 nm波长处测定吸光度值。

2.7 倒置显微镜观察细胞形态变化

肝癌HepG2细胞以每瓶1.6×106cells接种于12孔板培养过夜，不同实验浓度的样品溶液处理24 h后，倒置显微镜下观察细胞形态变化并进行照相。

2.8 统计学处理

3 结果

3.1 金钗石斛多糖的分离纯化

将上述实验所得到金钗石斛多糖，测得金钗石斛水提粗多糖得率为8.36%。金钗石斛粗多糖经DEAE-52纤维素阴离子交换柱分离纯化后，根据蒸馏水洗脱所得纯化金钗石斛多糖DNPL，得率5.32%。

3.2 金钗石斛多糖DNPL的纯度、中性糖含量和相对分子质量分析

根据图1所示金钗石斛粗多糖的HPGPC结果，可观察到多糖组分的洗脱曲线形态对称， 峰形单一， 表明其纯度较好，纯度达到了100%， 分子量分布较为均一。

图1 金钗石斛多糖高效凝胶色谱图

根据作得中性糖标准曲线回归方程Y=13.034X+0.132 8(r=0.997 1)，其中Y为吸光度，X为浓度(mg·mL-1)，根据金钗石斛粗多糖吸光度为0.912，计算得金钗石斛多糖DNPL中性糖含量为68.58%

金钗石斛粗多糖的HPGPC结果见图1，根据所作标准曲线回归方程Y=-0.319 4X+12.189(r=0.996 9)，其中Y为相对分子质量取以10为底的对数值，X为保留时间。由于HPLC检测使用的是示差检测器，倒峰为流动相溶剂的峰。根据金钗石斛粗多糖的保留时间24.234 min计算得金钗石斛多糖DNPL的平均相对分子质量2.8×104Da。

3.3 金钗石斛多糖DNPL对H2O2 诱导HepG2细胞保护作用的影响

过氧化氢H2O2进入HepG2肝癌细胞后可形成高活性的自由基，引起脂质过氧化等反应，破坏细胞结构，引起细胞衰老。结果表明，HepG2在H2O2作用下的细胞存活率为78.30%，与空白对照组比较具有显著性，表明造模成功；DNPL在浓度31.25、62.5、500、1000 μg·mL-1的作用下，存活率分别为65.70%、72.40%、74.60%、75.60%、90.70%、107.80%。金钗石斛多糖DNPL在浓度为1000 μg·mL-1时对HepG2在H2O2作用下的细胞存活率最大。金钗石斛多糖DNPL对H2O2诱导的肝癌细胞有明显的保护作用，随浓度的升高抗氧化作用增强，并且在浓度高于500 μg·mL-1后强于阳性参照CAPE的抗氧化作用，具有显著性，金钗石斛多糖可能具有明显的抗细胞衰老的作用[8]。

3.4 金钗石斛多糖DNPL对HepG2细胞生长影响

HepG2细胞是一种与人正常肝实质细胞具有同源性的肝癌细胞。结果表明(表1)，金钗石斛多糖直接对肝癌细胞HepG2没有明显抑制生长作用，仅在浓度为1000 μg·mL-1时细胞存活率分别为67.1%，显示其有轻度的抑制肿瘤细胞生长作用。

表1 MTT法检测金钗石斛多糖DNPL处理的细胞存活力

3.5 金钗石斛多糖(DNPL)对H2O2 诱导HepG2细胞形态的影响

过氧化氢H2O2进入HepG2肝癌细胞后可形成高活性的自由基，引起DNA损伤，脂质过氧化等反应，破坏细胞结构，引起细胞形态变化。试验结果表明(图2)，根据氧自由基清除及抗H2O2损伤记过对金钗石斛多糖DNPL观察对HepG2细胞形态变化影响。与正常细胞对照组比，金钗石斛多糖DNPL及阳性参照组细胞形态未见明显异常。

图2 倒置显微镜观察细胞形态变化(×10倍)

4 讨论

本实验选取金钗石斛为原料，通过水提醇沉获得粗多糖，然后经过DEAE-52柱色谱进行分离纯化，蒸馏水洗脱获得纯化金钗石斛多糖DNPL。对金钗石斛多糖的中性糖含量进行了初步分析，结果表明中金钗石斛粗多糖的中性糖含量为68.58%，相对分子质量为2.8×104Da。由于多糖结构的复杂性，尚未对此多糖进一步纯化和对精细结构进行进一步讨论，接下来本课题组拟通过糖组成分析部分酸水解、完全酸水解，酶解，红外和核磁共振等分析方法进行深入研究。

通过对金钗石斛多糖的抗氧化活性进行研究，结果表明金钗石斛多糖DNPL在浓度为1000 μg·mL-1时对HepG2在H2O2作用下的细胞存活率最大。随浓度的升高抗氧化作用增强，并且在浓度高于500 μg·mL-1后强于阳性参照CAPE的抗氧化作用，金钗石斛多糖具有明显的抗细胞衰老的作用。