胶体金免疫层析技术在食源性致病微生物检测中的应用

孔玉方，王慧煜，韩雪清

(中国检验检疫科学研究院,北京 大兴100176)

随着人们生活水平的提高,肉、蛋、奶类在人们日常餐桌上出现的数量猛增。因此,动物食品安全问题成为我国市场监督管理部门关注的重点。很多家畜因感染某些疾病,致使肉、蛋、奶中带入传染源,此类疾病传染性强,危害大,严重威胁人类健康。因此,早期快速检测对预防控制此类疾病的发生发展具有重大意义。胶体金免疫层析技术由于标记物制备简单、方法敏感、特异,不需要使用任何放射性同位素,应用范围广,如病原体、药物、激素、代谢物检测及饲料/食品和环境指标的监测[1]。该技术在食源性传染病检测方面的相关报道较少,因此本文就胶体金免疫层析技术在常见食源性传染病检测中的研究现状进行综述。

1 胶体金免疫层析技术

1.1 胶体金层析技术原理 胶体金免疫层析技术(Colloidal gold immunochroma-tography assay,GICA)是一种以胶体金作为标记物应用于检测特定抗原或抗体的一种新型免疫标记技术。胶体金在弱碱环境下带负电荷,可与带正电荷集团的蛋白质分子牢固结合,由于这种结合是静电结合,所以对蛋白质的生物特性不会产生任何影响。除蛋白质外胶体金还可以与其他生物大分子结合,如ConA、PHA、SPA 等。胶体金免疫标记技术主要利用了颗粒金具有高电子密度的特性,在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因此可用于定性或半定量的快速免疫检测方法中[2]。该技术成为继酶标记、荧光素和放射性同位素技术之后的又一重要的现代新型免疫标记技术。GICA技术已经成为目前检测食源性传染病致病菌最快速、敏感和特异的免疫学检测方法之一。

1.2 胶体金免疫层析技术的优点 近年来发展起来的免疫分析法、基因生物芯片、生物传感器和PCR 等检测技术被广泛应用于常见食源性传染病中。其中GICA 技术操作简单、生产成本低、检测范围广,不需要仪器设备检测；检测速度快,一般在5 ～15 min 就可得到肉眼可见的结果,可用于现场大批量样品的检测和流行病普查；GICA 试纸条稳定性好,室温可保存12 ～24 个月,检测结果室温下保存时间较长；GICA 试纸条在临床检验中可用于检测尿、唾液、全血、血清、血浆、体液等样品仅需简单处理或不处理即可检测,且样品用量极少。鉴于上述GICA 试纸条的优点,该技术比较适合食源性暴发流行病的现场即时检验等[3]。

2 胶体金免疫层析技术在病原生物检测中的应用

2.1 病原微生物方面的检测

2.1.1 细菌疾病 布鲁菌病是一种急慢性食源性人兽共患传染病,人主要通过接触病畜的流产物、乳、肉、皮毛而感染,当人的机体免疫力下降时,病原菌就会进入血液,形成菌血症。目前胶体金免疫层析技术由于标记物制备简单,检测速度快、敏感性高和样品用量极少的优点,被广泛的应用到食源性传染病的检测中。董浩等[4]采用GICA 和虎红平板凝集试验(RPST)对牛血清和羊血清进行了检测,结果GICA 检测法敏感性高于RPST 法,可有效的应用于家畜布病初筛试验当中。孔玉方等[5]将布鲁菌病表达纯化的OMP22 和OMP28 重组蛋白作为检测抗原,胶体金表面标记OMP22 和OMP28,制备胶体金免疫层析试纸条分别检测牛、羊血清各100 份,与虎红平板凝集试验和ELISA 试剂盒的检测结果符合率分别为97.4%和95%,检测布鲁菌病标准阳性血清的最低稀释度达1∶128。结果表明,该试纸条敏感性高、特异性强的特点。

结核病是由结核分支杆菌引发的一种人兽共患慢性传染病,牛是该病的易感动物,人多因食用感染病牛的牛奶、奶制品和肉类等而感染。人结核与牛结核可相互感染,禽结核也可感染牛和人。人感染结核后,治疗不及时极易造成患者死亡。牛结核病的流行传染,缩短了奶牛的寿命,产奶量逐渐降低,母牛的受孕率降低。,GICA 在预防此类疾病的发生发展中发挥了重大作用。Mduli 等[6]和Wassie 等[7]制备能够检测人结核分枝杆菌的GICA 试纸条,该试纸条具有较好的检测效果。李霜君等[8]采用GICA 法检测结核病患者和健康人血清样本中的特异性结核抗体IgG/IgM,结果该方法检测特异性结核抗体IgG/IgM 的特异性为91.67%,可用于结核病的筛查。

沙门菌病是由革兰阴性杆菌引发的一种常见食源性人兽共患病,人在食用被沙门菌污染的食物12 ～72 h 后,短时间内就会出现恶心、呕吐、腹痛、腹泻、发热,严重者出现败血症或导致患者死亡。我国每年有沙门菌造成的食物中毒事件占食品中毒总事件的40%～60%。因此,快速、高效的检测沙门菌具有重要意义。刘志科等[9]研制了一种鸡白痢沙门菌试纸条,检测临床采集的血清并用平板凝集试验对其准确性进行验证,结果与平板凝集试验的符合率达96.43%。刘景武等[10]研制了一种以胶体金标记沙门菌血清抗体,用于检测氯化钠洛液、沙门菌、大肠杆菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、小肠结肠耶尔森菌等细菌,结果21 株沙门菌均为阳性而其他的检测结果均为阴性,灵敏度为106CFU/mL。

2.1.2 病毒疾病 口蹄疫是由口蹄疫病毒引发的既可严重侵害家畜、野生动物又可感染人的一种高度传染、急性烈性热性接触性和复杂多变的传染病。人通过与患病动物直接接触,或者接触到带毒气溶胶或污染的食物,特别是被污染的牛奶而感染。林彤等[11]制备的FMDV AsiaⅠ型的胶体金试纸条,用于检测猪水疱病病毒和FMDV 的其他血清型无交叉反应发生,而且该试纸条与其他常规检测方法的符合率达98.8%。Jiang 等[12]研制了一种检测FMDV 的双抗体夹心GICA 法,该方法检测时间为15 min,灵敏度为11.7 ng/mL。

2.2 寄生虫方面的检测 旋毛虫病是一种呈世界性分布的食源性人兽共患寄生虫病,人多生食或半生食含有旋毛虫幼虫囊包的猪肉及肉制品而感染。旋毛虫病需在横纹肌里查找和摘取囊包幼虫压片镜检,取材困难,检出率仅为50%左右,导致临床诊断极度困难[13],秦银霞等[14]以胶体金标记葡萄球菌蛋白A(SPA)和旋毛虫肌幼虫排泄分泌抗原构建免疫层析试纸条,用于检测旋毛虫感染血清,结果试纸条对旋毛虫病患者、猪血清检测率为100%,旋毛虫感染小鼠的检出率为97.87%。表明试纸条实用强。

广州管圆线虫病是一种新现的脑内食源性人兽共患寄生虫病,主要侵犯人的中枢神经。人多因生食或半生食被三期幼虫污染的水生动物而感染。目前,金标病原学检测需从患者的脑脊液或其他部位查到Ⅳ期或Ⅴ期幼虫,才可确诊,由于寄生位置特殊,致使漏诊误诊率高,。郝振华等[15]建立了一种适用于基层检测广州管圆线虫病的试纸条,用于检测小鼠阳性血清抗体。结果该方法检测的敏感性和特异性均为100%。胶体金免疫层析法有望应用于广州管圆线虫病现场流行病学调查和临床快速筛查。

链状带绦虫[Taenia solium(Linnaeus,1758)]人多因误食生的或未煮熟的含活囊尾蚴的猪肉而感染。确诊猪带绦虫病的免疫学诊断主要是通过检测血清中特异性抗体,采用的抗原主要是排泄分泌抗原、囊液抗原和成虫抗原,由于这些抗原成分复杂,获取和纯化操作比较繁琐。张少华等[16]建立了一种以胶体金标记猪带绦虫六钩蚴重组蛋白(TSOL18)的双抗原夹心试纸条,用于检测猪血清样品,结果该试纸条检测的敏感性和特异性分别为75%和95.2%。

3 展望

胶体金免疫层析技术以其生产成本低、操作简单、检测快速、敏感、特异,结果肉眼可观,不需要其他设备仪器等优点被广泛应用于食源性人兽共患传染病现场检测和临床快速诊断中,成为当今学者研究的热点。但胶体金免疫层析技术尚存在不足之处,如灵敏度低,假阳性、假阴性,重复性不高和定量不准确等问题。中国检科院刘佳佳等[17]制备了一种牛布鲁菌荧光标记免疫层析试纸条,最低可检测出1∶100 牛布鲁菌标准阳性血清,并且与商品化的ELISA 试剂盒符合率达93.5%,表明荧光标记的试纸条灵敏度更高。李广强等[18]采用量子点标记技术检测布病,检测布病抗体的敏感性为99%,特异性为95.8%。相信随着荧光量子点和镧系金属等标记技术的不断成熟可有效的提高免疫标记技术的敏感性、特异性,并实现高通量检测,定量或半定量检测是将来该技术发展的主要趋势。