酱油香气成分分析研究进展

刘 翔，邓 冲，侯 杰，周其洋*

（佛山市海天（高明）调味食品有限公司，广东 佛山 528500）

酱油酿造历史悠久，主要用大豆、豆粕、小麦、面粉、麦麸经微生物发酵而成[1]，不同原料、菌种、发酵工艺和添加剂调配对酱油风味影响显著[2]，且不同地区、企业酿造的酱油各具特色，因此各品牌酱油风格迥异[3-4]。酱油风味包括滋味和香气两个部分，滋味由酸、甜、苦、咸、鲜五种味道协同作用形成；然而香气呈现非常复杂，国内外研究多年并没有形成统一的认识。关于酱油香气最典型的描述有酱香、酯香、豉香，但这三类香气并没有严格定义，酿造者的理解存在差异[5-6]。酱油中香气成分的组成取决于酿造原料、生产工艺及参与发酵微生物等因素，并且环境温度、光照、压力及环境污染物也会影响酱油香气成分组成。酱油香气成分种类繁多、挥发性高、不稳定、大多含量低，且分散在以糖、蛋白、氨基酸、脂肪、盐和水为主要介质的混合物中，因此，采用稳定、灵敏、高效的提取分离方法，结合先进的检测仪器是分析酱油中香气成分的关键[7-10]。

本文阐述了溶剂辅助蒸发萃取（solvent assisted flavor evaporation，SAFE）、顶空固相微萃取（headspace-solid phase m icroextraction，HS-SPME）、溶剂萃取等香气成分提取方法和气质联用（gaschromatography-massspectrometry，GC-MS）、气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）法等香气成分分析方法[11-14]以及原材料和酿造工艺对香气影响；旨在澄清酱油呈香特点，为酱油酿造提供指导，对国内外深入研究酱油提供参考。

1 酱油香气成分分析方法

1.1 香气提取方法

香气分析研究首先需要分离富集挥发性化合物，常用方法非常多，且各具有优缺点。分析酱油香气时应根据酱油特质，选择合适的前处理方法才能真实、准确的揭示香气成分。

1.1.1 溶剂辅助蒸发萃取

溶剂辅助蒸发萃取能有效提取低挥发性成分且香气自然逼真、无杂味、不含高沸点物质，但装置复杂、成本高、清洗费时；然而为了更真实呈现酱油香气成分，酱油关键香气成分分析研究时使用较多[15-16]。

1.1.2 同时蒸馏萃取

同时蒸馏萃取（simultaneousdistillation extaraction，SDE）适合收集挥发性低的化合物，挥发性高的物质易损失，提取强亲水性化合物效率低，加热易造成人为假象。据冯云子[2]研究表明，SDE对高盐稀态酱油香气物质的萃取以醛类物质为主。高献礼等[17]研究表明，SDE处理样品，共鉴定出高盐稀态酱油挥发性风味化合物44种，其中酸类10.28%，醇类3.68%，醛类23.57%，酯类39.57%，呋喃类0.58%，酮类1.02%，杂环化合物6.84%，酚类3.86%。

1.1.3 顶空气体捕集

顶空气体捕集能快速有效萃取挥发性化合物，最接近人体嗅觉所能感觉到的气味，但低挥发性物质萃取能力弱，仪器费用较高；酱油香气分析应用非常少，酱油关键香气物质羟基呋喃酮类化合物和羟基吡喃酮类化合物不能被检测到，且总检出成分少于同时蒸馏萃取和溶剂萃取[10，18]。

1.1.4 溶剂萃取

溶剂萃取（slovent extraction，SE）使用较多，具有操作简单、成本低、分离香气化合物多的优点，但香气会损失、溶剂残留掩盖低沸点物质、不适合含脂肪样品。使用该方法分析酱油香气的研究较多[4，9，19-23]，常用萃取溶剂有二氯甲烷和乙醚。ZHENG J等[4]用乙醚和二氯甲烷混合液萃取有利用萃取更多的香气物质；赵谋明等[1，19]研究发现，相比于顶空固相微萃取，SE对呋喃（酮）类、酸类化合物的萃取效果较好；为获得更好的提取效果，罗龙娟[23]用二氯甲烷结合酸碱调节的方式萃取了酱油酸性、中性、碱性部分的挥发性成分，该方法实现了萃取成分的简单分类。

1.1.5 顶空固相微萃取

顶空固相微萃取（HS-SPME）使用最多[22-23]，该法有集样品预处理、萃取于一体、操作快速简单、费用低、可减少香气损失、方便与气相联用等优点，但萃取头不同涂层会选择吸附香气化合物，不能采用溶剂进行稀释。赵谋明等[1，19]研究发现，HS-SPME相比溶剂萃取能提取较多的醛类、含硫化合物；高献礼等[17]研究表明，HS-SPME更适合分析杂环类等挥发性较强的物质，这类物质对酱油呈香至关重要；黄毅[24]对比了7种方法对酱油香气成分的提取效果，表明HS-SPME可鉴定出最多的香气成分。

鉴于萃取方法的优缺点，不同前处理方法分析样品，得到化合物的种类和数量也不尽相同，可针对酱油特性和分析要求有针对性的选择前处理方法。如分析生酱油时应避免使用SDE，可选用常用的SE和HS-SPME；分析热处理后酱油时，为确定酱油风味轮廓可选用SDE和HS-SPME；分析人直接嗅闻酱油时的呈现香气成分，不考虑加热使用时的香气特征时，可选用SAFE和顶空气体捕集。此外，使用多种方法结合各方法特点辩证分析，才能获得更全面的酱油香气成分特征。

1.2 香气成分定性方法

香气定性分析常用仪器有气相色谱（gaschromatography，GC）、气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）、气相色谱-嗅闻仪（GC-O）、二维或多维气质联用仪。很多香气成分含量低，由于阈值低同样能够贡香，但是在普通质谱检测器上很难鉴定岀来，需要使用专用检测器，如含硫磷检测器与氮磷检测器等。结合使用多种定性方法可提高定性准确性，定性方法有标准品比对法、保留指数（retention index，RI）法、谱库检索法以及感官气味比较[25]。

酱油香气分析文献大部分使用GC-MS检测酱油挥发性化合物，使用质谱计算机自带的美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）2.0谱库和Wiley谱库检索进行定性[21，26]，部分研究人员为进一步确定定性准确性使用标准品对标做进一步确认[27]。相比于单独使用GC-MS，BAEK H H等[28-30]联合使用GC-MS和GC-O，通过谱库检索、RI比对和化合物香气特性分析共同定性的方法更准确，如MS谱库检索时，匹配度接近的化合物常有好几种，这时可根据哪个物质的呈香特征与GC-O嗅闻到的香气一致做出准确判断。此外，受色谱分离效果影响，一些物质不能很好分离，将影响定性结果，二维或多维气质联机法能够很好解决这一问题，但未见有在酱油香气分析的应用报道。酱油发酵和美拉德反应生成化合物对香气贡献显著，其中醇、醛、酸、酯、含氮杂环、含硫杂环类物质众多，单独依靠一种检测器很难对挥发性成分精准定性，但也未见有使用多种或特种检测器分析酱油香气的文献。

1.3 关键致香成分鉴定方法

由于样品的挥发性成分中只有一小部分具有香味活性，需进一步筛选挥发性物质，才能确定对样品具有香气贡献的致香成分。目前，鉴别样品挥发性成分中关键致香成分常结合使用GC-O和萃取香气稀释分析（aromatic extraction dilution analysis，AEDA），这种方法被广泛应用于食品风味的研究中。GC-O根据保留指数和嗅闻气味，通过查找对比实现其与具体化合物的匹配，从而鉴定出气味活性物质。然而，单独使用GC-O鉴定精确性低。气相-质谱-嗅闻仪（GC-MS-olfactometry，GC-MS-O）将质谱与嗅闻仪器连接成一体，同时检测样品中气味活性物质，增加质谱谱库检索与嗅闻香气的实时对应，可大大提高致香成分分析的精确性。通过萃取香气的稀释分析可准确判断各挥发性成分的贡香强度[25]。此外，定量检测挥发性成分含量，根据阈值计算香气活性值（odor activity values，OAV）同样可以间接推测关键致香成分及其贡香强度[31]。

从对白酒致香成分分析及白酒香气调配技术的案例中，不难发现确定关键成分，通过标准化合物反添加能构建出样品的主体香，所以酱油也可以通过同样方法找到关键成分，指导生产工艺优化。然而酱油中已鉴定出的挥发性化合物非常多，确定关键香气化合物至关重要，国内外有不少关于酱油致香成分鉴定的研究报道。如BONKOHARA K等[26]通过酱油关键香气成分分析，反添加配出与酱油香气相似的化合物混合液；赵谋明等[30]采用GC-MS和GC-O鉴定出39种香气活性物质并结合OAV值确定了15种关键致香成分；康文丽等[32]采用GC-MS的质谱定性和GC-O嗅闻判断鉴定出24种香气活性物质，通过GC-MS定量计算灭菌前后OAV值差异确定了酱油灭菌前后香气差异原因。因此，确定致香成分对研究酱油香气具有非常大的应用价值，而且国内致香成分分析技术日趋成熟，如北京工商大学在香精、江南大学在酒类及食品领域有了非常多的研究及应用案例。

1.4 香气成分定量方法

定量分析方法主要有外标法、内标法、面积归一化法，3种定量法各具优点，但也存在一定局限性。外标法适用于大量检测样品，但进样重复性和实验条件稳定性将影响检测准确性；内标法是一种间接校准法，此法在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差，但易増加面积积分误差；面积归一化法测定含量为相对值，操作简便，并且操作条件的变动和进样量的准确性对检测结果的影响小，但需要所有峰值全部流岀后统一积分计算。实际香气定量应用中，当挥发性物质较多，定性分析时，常用面积归一化法确定物质相对含量。

酱油香气相关文献中，相对定量面积归一化法[21，33-35]和间接定量内标法[36-38]使用最多，准确定量外标法[11]报道较少。一方面由于定量检测方法本身，面积归一化最简单、内标法需建立内标化合物的标准曲线、外标法需所有定量化合物标准品；另一方面酱油作为传统调味品，国内香气分析起步晚，行业内还没有建立酱油香气成分和气味之间的关联，挥发性香气化合物的定性定量检测评估、指导酿造工艺的应用价值尚未被挖掘展现出来。同为传统发酵食品的白酒，在香气定量分析研究较多且应用技术成熟，可为酱油香气研究提供借鉴。

2 酱油香气成分分析进展

2.1 酱油微量香气化合物分析

酱油微量香气化合物的定性研究较多，大量挥发性成分被鉴定报道。不少文献结合挥发物种类、含量及统计学方法分析了酱油特征。如赵谋明等[30]在酱油中鉴定挥发性成分109种，其中醇占比高达75.8%，醛、酯、酸、呋喃（酮）占比依次减小。LEE K E等[35]使用固相微萃取和溶剂萃取酱油，分别鉴定出挥发物107种和81种，包括酸、醛、酯、酮、酚、呋喃以及呋喃衍生物。MENG Q等[37]在发酵酱油中检测到2-甲基-3-呋喃甲醇，含量远高于阈值，随酱油热处理温度升高而增加，确定为酱油的熟肉类香气的主要贡香成分；然而酸水解植物蛋白酱油中未检测到，说明微生物发酵促进该成分生成，而半胱氨酸被认为是关键前体物质。GAO L H等[39]检测了12种市售酱油，通过41种挥发性成分的聚类分析，有效区分并评估了酱油质量；对比发现不同酱油香气差异大，低盐固态酱油挥发性香气物质少。SUN S Y等[40]在12种高稀态酱油中鉴定出34种共有的挥发性成分；在含量上，醇、酸占比大，主要挥发性醇是乙醇、2/3-甲基丁醇和β-苯乙醇，主要挥发性酸是乙酸、丁酸和3-甲基丁酸；此外杂环、酯、呋喃和苯酚类占比较大；经主成分分析可将12种酱油分为4组，同组酱油挥发性成分更接近。朱新贵等[41]鉴定出挥发性化合物134种，其中酯类占比最高，且日式酱油比广式酱油高30.6%，这种差异造直接导致两种酱油风格完全不同。由于检测方法以及酱油香气不同，检测出的微量香气化成分存在差异。

2.2 酱油关键致香成分分析

正如前述，酱油中的微量化合物众多，酱油香气由很多单体风味化合物贡献出来，而这些单体成分在酱油中的含量、阈值不同，其OAV也不同，从而对酱油香气贡献也不相同。对酱油香气贡献度大的化合物是致香成分，因此从酱油中分离、鉴定它们是香气分析的关键。

不少文献报道，使用AEDA检测香气稀释因子（flavor dilution factor，FD）的方法，鉴定了酱油中关键致香化合物。冯云子[2]检测日本酱油确定36种致香成分，其中最强烈的香气活性成分是2-甲基丙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、4-甲基戊酸乙酯、3-甲硫基丙醛、1-辛烯-3-醇、2-甲氧基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、2-苯基乙醇和正4-羟基-2（5）-乙基-5（2）-甲基-3（2H）呋喃酮（N-4-hydroxy-2(5)-ethyl-5(2)-methyl-3(2H)furan，HEMF）。KANEKO S等[3]分析5类香气不同的日本酱油，共确定25种关键香气成分，其中3-甲硫基丙醛和3-羟基-4,5-二甲基-2（5H）-呋喃酮（sotolon）的FD值高；4-乙基-2-甲氧基苯酚仅在4种酱油中具有高FD值；此外，HEMF和HDMF仅是一类酱油的致香成分，在另外4类酱油中FD值差异大。STEINHAUS P等[9]同时采用AEDA和OAV值分析日本酱油，发现30种气味活性化合物，其中2-苯基乙醇FD值最高，其次是3-甲硫基丙醛、HEMF、HDMF和sotolon；定量13种气味活性化合物计算OAV值，发现3-甲基丁醛、sotolon、HEMF、2-甲基丁醛、甲硫氨酸、乙醇和2-甲基丙酸乙酯贡香较大；两种方法确定致香成分存在一定差异。MENG Q等[15]研究表明，生酱油中2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯和4-甲基戊酸乙酯的FD值高，乙酸乙酯是赋予生酱油果香的关键成分。LEE S等[20]研究表明，发酵酱油的主要气味活性化合物是乙酸、糠醇、2-甲氧基苯酚、苯乙醇、苯甲酸、丁酸、HEMF、2-基丁醛；酸水解酱油是乙酸、2-甲氧基苯酚、甲酸、苯甲酸、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、丁酸、2,6-二甲氧基苯酚、3-羟基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮、2-乙酰基-5-甲基呋喃、2,5-二甲基-3-乙基吡嗪和2-甲基丁醛。除AEDA分析外，也有文献通过计算OAV值确定致香化合物。BONKOHARA K等[26]研究发现，乙酸、HEMF、异戊醇和3-甲基硫丙醛在酱油中具有较高的FD值，将这些化合物以一定比例混合可配出酱油香精。BAEK HH等[28]检测酱油中甲硫基丙醛FD值最高，其次3-甲基丁酸和2,5-二甲基-4-羟基-3（2H）-呋喃酮（2,5-dimethyl-4-hydroxy-3（2H）-furanone，HDMF），酱油特征香味成分HEMF也表现出了相对较高的FD值。KANEKO S等[29]鉴定日本生酱油和热处理酱油发现，HEMF和表现出最高的FD值，其次是3-甲硫基丙醛、4-乙基-2-甲氧基苯酚和HDMF。赵谋明等[30]研究表明，3-甲基丁醛的OAV值高达2 215，对酱油香气贡献最强；2-甲基丁醛、2-甲基丙醛、3-甲基戊酸、3-甲硫基丙醛、4-甲基戊酸乙酯、乙醇、HEMF的OAV值在数百级别，对香气贡献稍次；苯乙醛、甲硫醚、1-辛烯-3-醇、2-甲基丙酸乙酯、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、二甲基三硫、HDMF、乙酸、3-甲硫基丙酸乙酯、愈创木酚OAV值在数十级别，对酱油香气存在贡献。康文丽等[32]通过计算OAV值发现，3-甲硫基丙醛在灭菌前后酱油中的OAV值高达2 869、3 797，对酱油香气贡献极其显著；麦芽酚、HEMF的OAV值在280～400之间，对香气贡献稍次；苯乙醛、己醛、HDMF、愈创木酚、3-甲硫基丙醇、芳樟醇、4-乙基愈创木酚、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪的OAV值在数十级别，对酱油香气存在贡献。

综合以上研究，日本酱油香气成分中3-甲硫基丙醛（土豆味、肉类香气）、HEMF（焦糖香）、HDMF（焦糖香）和sotolon（焦糖香）最常被鉴定为关键香气成分；中国酱油关键致香成分分析文献中，3-甲硫基丙醛、HEMF、HDMF、苯乙醛（花香）、愈创木酚（熏烤香）被共同鉴定为致香成分，其他重要致香成分仍存在较大差异，可能与酱油本身香气差异有关。

2.3 原料和酿造工艺对香气成分的影响

2.3.1 原料对香气成分的影响

优质的原料决定优质的产品。古人云：巧妇难为无米之炊。酱油中的风味物资来源于原料，原料的选取对酱油风味的形成起着关键作用。传统酱油酿造采用大豆小麦作为原料。大豆发酵产生出的酱油营养丰富，味道醇厚。大豆含有丰富的油脂，在发酵过程中生成高级酯类与脂肪酸。如用豆粕等原料代替大豆，节约成本的同时也降低了酱油原油的风味。小麦作为微生物发酵的碳源，也是微生物发酵风味物质产生的基质。小麦的淀粉含量高，满足微生物生长繁殖的同时能够被各种酶水解生成各种糖、醇、酸和酯物质，这些物质构成风味物质及风味物质前体物。经烘焙的小麦更能产生麦芽酚等芳香成分。如使用麸皮代替小麦酿造出的糖、醇、酸和酯物质明显减少，风味物质明显不足。所以，酿造酱油中原料的选择对酱油的质量影响很大。为了生产出优质的酱油，可以调整原料用量、比例及增加原料预处理工序。

2.3.2 制曲微生物对香气成分的影响

制取微生物代谢产生丰富的酶系的同时为发酵生香提供前体物质，对酱油香气影响显著。其中LIU J等[21]用嗜盐酵母与米曲霉同时接种制曲，发现酵母参与制曲可提高2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、乙酸乙酯和1-辛烯-3-醇含量，增强了曲香且发酵获得酱油酱香更浓郁，为提升酱油风味提供了新思路。CHEN Z Y等[33]对比研究了米曲霉混菌和纯曲发酵香气差异发现，米曲霉和红曲霉混菌制曲酱油中酯、醛、吡嗪、含硫类风味物质含量升高，但感官上醇香和酸香较浓郁。XU N等[38]研究了米曲霉菌体自溶对挥发性成分影响，发现菌体自溶物中检测出酱油特征成分2-苯乙醇和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚，添加菌体自溶物质发酵酱油可促进醇、醛、酚和酯类香气物质生成。推测原因，此类物质原料中含量少，可由微生物代谢产生，菌体自溶的过程释放了此类香气物质；同时菌体自溶释放的微生物源蛋白质、氨基酸、还原糖、核酸、有机酸增加了生香反应底物和反应速度。

2.3.3 发酵微生物对香气成分的影响

发酵过程中主要微生物有酵母菌、乳酸菌，其代谢可直接生成香气物质，提升酱油香气品质。CUI R Y等[31]在酱油发酵过程分别添加一株乳酸菌和两株酵母，研究嗜盐乳酸菌及酵母菌对酱油风味影响，发现挥发性化合物总量分别增加了117.6%、23.2%和216.8%，而主要的9种化合物OAV值增加1.00～7.87倍，且3种菌株混菌发酵有利于提升酱油香气。LEE K E等[35]研究发现，乳酸菌参与发酵的酱油主要挥发物是乙酸、甲酸、苯甲醛、乙酸甲酯、2-羟基丙酸乙酯、2-羟基-3-甲基-2-环戊烯-1-酮和4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，而酵母菌参与发酵的酱油主要是乙醇、乙醛、丙酸乙酯、2/3-甲基丁醇、1-丁醇、2-苯基乙醇、2-甲基丙酸乙酯和HEMF，由于主要挥发性化合物不同，说明乳酸和酵母菌具有不同的酒精发酵和乳酸发酵代谢途径，对酱油香气贡献也不一样。HARADA R等[42]研究了微生物及其产物对酱油香气影响，发现单独添加乙醇生香单一，说明酱油香气成分由酵母代谢产生，并非乙醇转化；而添加乳酸菌的酱油与添加乙酸、乳酸的酱油香气成分变化相似，菌体代谢和产物转化与影响致香成分HDMF生成。

2.3.4 热处理对香气成分的影响

酱油热处理引起的美拉德反应生香、高挥发性香气成分损失，直接改变酱油香气，如生酱油和热处理酱油香气风格上存在显著差异。STEINHAUS P等[9]研究发现，热处理将导致酱油的整体香气成分发生明显变化，其中致香成分sotolon含量显著降低，而2-乙酰基-1-吡咯啉、HDMF和HEMF含量增加。KANEKO S等[29]研究发现，生酱油加热后2-甲氧基-4-乙烯基苯酚和2,6-二甲氧基-4-乙烯基苯酚的FD值显著增加，另外3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、甲硫氨酸、苯乙醛、HDMF也有增加。康文丽等[32]研究了高盐稀态酱油灭菌前后香气活性成分，发现麦芽酚、3-甲硫基丙醛、HEMF、愈创木酚和4-乙基愈创木酚、HDMF、己醛、香兰素含量变化造成了灭菌前后香气差异；酱油灭菌前头香中的烟熏香气突出，灭菌后头香中豆的青香和甜香、以及体香和基香中的酱香与焦甜得到增强，且香气强度大，留香时间长。MENG Q等[37]分析发现，3种挥发性硫醇、2-呋喃甲硫醇、苯甲硫醇、2-巯基丙酸乙酯有助于热处理酱油的香气，其含量显著高于阈值；当生酱油加热时其浓度增加，标品反添加至生酱油，其香气变得与热处理酱油香气相似。高献礼[43]加热酱油后乙醇、醛、酮含量降低，感官对应的醇香、焦糖香、烟雾香下降；而呋喃（酮）、酚及其含硫化合物含量会升高。

3 展望

总结近年来关于酱油香气研究，使用多种香气提取方法，成分定性定量手段以及香气酿造工艺研究，鉴定出大量的香气化合物，确定了关键致香物质，并且发现了各工艺因素对酱油香气的影响。通过已有研究可知，目前的香气分析技术已经比较成熟，可用于酱油香气分析，指导酿造工艺。其中，香气提取方法可根据酱油特性和分析要求有针对性的选择前处理方法，或者采用多种方法辩证分析；香气鉴别可使用GC-MS-O结合OAV值和香气特性共同确定关键致香成分；通过关键成分的外标法精确定量分析，建立香气成分变化与香气感官之间的联系，进而优化酿造工艺，提升酱油的产品质量。随着香气分析技术的不断发展，酱油香气生成机理研究的逐步深入，香气成分对酱油香气贡献以及酿造工艺对香气的影响终将被阐释清楚。