外源性线粒体植入治疗线粒体疾病的研究进展*

齐悦 龚树生

线粒体是细胞有氧呼吸的主要场所，为细胞和组织提供生命活动所必需的能量，是人类最重要的细胞器之一。线粒体在葡萄糖和脂肪的代谢，氧化磷酸化及细胞凋亡等过程中发挥着至关重要的作用[1，2]，线粒体功能的异常可导致老化[3]及多器官多系统的疾病[4，5]。线粒体基因不受组蛋白保护，因此具有高突变率[6]，常导致母系遗传的先天性疾病；此外，线粒体也是最易受环境有害因素攻击的细胞器之一，目前研究证实线粒体功能障碍与心血管疾病[7]、肥胖[8]、糖尿病[9]、神经系统和肌退行性疾病[10，11]、综合征型和非综合征型耳聋[12，13]等多种常见病以及部分罕见病[14]相关。

目前临床上尚无有效的治疗方法治愈线粒体疾病。近年来，通过植入外源性线粒体或外源性线粒体DNA纠正先天性线粒体遗传病及后天性线粒体功能障碍成为新的研究热点。2016年，Kang等[15]成功地通过线粒体置换技术对人卵母细胞的线粒体DNA 致病突变进行纠正，这项研究成为线粒体遗传病治疗上的重大突破；然而无论是技术难度，还是涉及的伦理问题和潜在的重大风险都使其难以在临床上推广。最新研究发现在成熟的体细胞周围植入外源性线粒体，也可使线粒体功能缺陷的细胞和组织恢复线粒体功能[16]；这种外源性线粒体的植入主要有两种，即植入携带正常线粒体的细胞和植入独立的功能性线粒体。外源性线粒体植入的治疗作用已在多种线粒体疾病动物模型上得以证实[17，18]，为线粒体疾病提供了一种新的治疗方向。本文对外源性线粒体植入的相关研究进展进行综述，旨在探讨外源性线粒体植入对线粒体疾病的治疗效果及作用机制，并为其应用于线粒体聋病的治疗提供理论依据。

1 外源性细胞内线粒体的跨细胞转运及治疗意义

2006年，Spees等[16]对是否能通过植入外源性线粒体或线粒体DNA(mtDNA)，使其跨细胞转移进入无线粒体功能的细胞并进行线粒体功能修复进行了研究，研究通过溴化乙锭使细胞的mtDNA产生突变并丧失功能，成为无法有氧呼吸和生长的A549细胞，然后将人骨髓非造血祖细胞(stem/progenitor cells from human bone marrow，hMSCs)和成纤维细胞分别与这种线粒体缺陷的A549细胞共孵育，结果发现，培养出了携带有功能线粒体的A549细胞，这些功能线粒体来自于hMSCs和成纤维细胞，提示细胞间出现了线粒体的跨细胞转移并可恢复A549细胞的有氧呼吸功能。这种通过获取其他类型细胞的外源性线粒体来恢复细胞自身线粒体缺陷的现象，随后在Tan等[19]的动物在体实验中也得到了证实，2014年Tan等将缺乏mtDNA的肿瘤细胞皮下注射到同种系小鼠后，这些原本丧失了增殖功能的肿瘤细胞逐渐恢复了增殖能力，研究在增殖的肿瘤细胞中发现了宿主小鼠的mtDNA及具有功能的线粒体。

在离体细胞培养实验中已有研究证实了骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived stromal cells，BMSCs)可将正常的线粒体转移到有线粒体缺陷的内皮细胞、A549细胞以及心肌细胞[16，20，21]，但在活体肺中，外源性BMSCs的线粒体转移及其潜在的治疗效果尚待研究；Islam等[18]建立了急性肺损伤的动物模型，并对活体肺灌注健康的BMSCs，发现灌注的BMSC首先附着于肺泡，在随后的24小时内BMSC将线粒体逐渐的转移到肺泡上皮细胞，并显著增加了肺泡的ATP水平，对肺组织的急性期损伤可起到积极的保护作用。

随着研究的进展，这种外源性线粒体的跨细胞转运在越来越多的细胞类型中被发现和证实。在Robicsek等[22]的研究中，外源性线粒体可以自发的进入多种类型细胞，继而可改善受体细胞受损的线粒体功能，这种外源性线粒体进入不同类型细胞的过程常在数分钟内即可完成。上述研究结果提示线粒体的跨细胞转运并不是某种细胞特有的功能，而可能是细胞普遍具有的能力。

2 孤立外源性线粒体的跨细胞转运及治疗意义

相对于细胞而言，注射直径仅4～6 nm大小的线粒体可显著减少因注射而造成的机体损伤，并且可减少免疫排斥反应，更适宜应用于在体研究。目前研究已证实，局部缺血可导致线粒体损伤和功能障碍，这些受损的线粒体在再灌注过程中会对细胞生存产生负面影响[23，24]。为了减少这种负面影响，2008年McCully等[17]从未受损的兔心肌组织分离提取出了形态完整且具有功能的孤立线粒体，将其直接注射到自体缺血的心肌组织中，2小时后的检测结果显示注射的外源性线粒体仍存活并保持着完好的膜电位和功能，同时有效的减少了肌酸激酶、肌钙蛋白Ⅰ等反映心肌损伤的指标和心肌的梗死面积，并且没有造成心律失常等不良反应；然而，这项研究中注入的外源性线粒体聚集在心外膜表面的心肌纤维间而没有进入肌细胞。2013年Masuzawa等[25]在该项研究的基础上采用上述方法从兔胸大肌组织中分离出具有功能的孤立线粒体，并直接注射到自体缺血的心肌组织,和前述研究相比，该研究延长了注射后的线粒体观测时间，发现移植的外源性线粒体先在心肌细胞间隙明显聚集，2 h后附着在心肌细胞表面，在移植后的8～24小时外源性线粒体逐渐被整合到心肌细胞中被心肌细胞所内化，进而减少心肌细胞的凋亡和心肌梗死面积。同年，Lin等[26]将分离出的外源性线粒体用于减轻大鼠缺血再灌注的肝损伤,缺血后再灌注损伤是肝移植和肝切除术面临的一个临床难题;该研究从鼠的肝细胞中分离出独立的线粒体并注射到脾囊膜区域，这些外源性线粒体经脾静脉回流进入肝脏门脉系统最终到达缺血后再灌注的肝区；植入后的240 min，外源性线粒体在受体动物肝细胞中仍保持着完整膜电位，明显的减轻了再灌注后的肝组织损伤，减少了氧化应激和细胞死亡。上述研究提示，孤立的外源性线粒体植入可应用于减少多脏器的缺血再灌注损伤；减少缺血后的再灌注损伤不仅在治疗缺血性疾病中有重要的临床治疗价值，也对组织及器官移植等手术中减少机体损伤有着重要的意义。除了应用于减少多脏器的缺血再灌注损伤外，外源性线粒体植入在精神分裂症[22]、阿尔兹海默症[27]、帕金森病[28]等神经系统疾病动物模型中的治疗作用也得到了证实。

研究已证明植入外源性线粒体对线粒体受损的脑、心脏、肝脏和肺组织等有治疗作用，以上研究均采用的是自体或同种系动物的外源性线粒体进行移植，而将源自不同种属动物的线粒体移植到受损宿主组织是否也能保持外源性线粒体的存活并起到类似的治疗作用？为了解答这一问题，2016年Huang等[29]从仓鼠细胞系中提取出有功能的线粒体，通过脑内或系统内动脉注射的方式将这些分离出来的外源性线粒体植入缺血的大鼠脑组织(主要是大脑皮层神经元)，结果发现这些源于仓鼠的线粒体也能恢复脑缺血大鼠的运动性能，可显著减少脑梗死区域和神经元细胞死亡数量；该研究在脑缺血大鼠的神经元和星形胶质细胞中都观察到了内化的仓鼠线粒体。这些结果强调异种外源性线粒体也可以有效地对抗中枢神经系统中的急性缺血性损伤，同时研究还发现，细胞中分离的外源性线粒体不仅能对抗急性损伤，也能对脑组织有长期保护作用。不仅来源于异种属动物的线粒体可以通过跨细胞转运进入受体细胞，从植物(如雪松等)叶子中分离出的线粒体也可以在30分钟内进入人体细胞并保持有活性[28]。

关于外源性线粒体植入的途径，在临床上直接进行上述的心脏注射、脑区注射或脾脏注射存在诸多风险。最近的一项动物实验证明[28]，静脉注射有活性的外源性线粒体后，小鼠的多种不同组织(如脑、肝脏、肾脏、肌肉和心脏)中均可检测到有功能的外源性线粒体，并同样具有治疗作用。在Shi等[28]的研究中，通过静脉注射的这些外源性线粒体不仅增加了正常的小鼠耐力，也通过增加电子传递链的活动，减少ROS水平，防止细胞凋亡和坏死，进而阻止了帕金森病(Parkinson's disease，PD)小鼠疾病的进展；同时，研究还对血液中的红细胞进行检测，结果发现外源性线粒体并未进入到成熟的红细胞，成熟的红细胞不具有线粒体，因而可避免在运输氧的过程中耗氧，因此，这种静脉注射外源性线粒体的治疗方法不会影响红细胞运输氧的功能。上述研究表明通过静脉注射进行外源性线粒体植入可能是一种更为安全、有效且易于实施的植入方式。

3 外源性线粒体跨细胞转运的机制

植入携带有线粒体的外源性细胞或者孤立的外源性线粒体，已被证实可在多种细胞自发的进行跨细胞转运。然而，这种外源性线粒体的跨细胞转运机制尚不明确，目前研究认为细胞融合、各种细胞间的细胞质桥接以及分泌囊泡外泌体等可能是其机制。

在植入携带外源性线粒体细胞的研究中，首先需要明确的是线粒体是以完整的线粒体形式还是mtDNA形式从植入的外源性细胞进入受体细胞。Cho等[30]通过线粒体内膜染料R6G对完整的外源性线粒体进行标记，结果表明受体细胞恢复线粒体功能是由于完整的线粒体转移，而不仅仅是mtDNA转移。对于其转移机制的研究，Spees等[16]将hMSCs和成纤维细胞分别与线粒体缺陷的A549细胞共孵育，为了确认线粒体从hMSCs和成纤维细胞转移到A549细胞的过程是否发生了细胞融合，分析了核DNA和mtDNA，发现A549细胞中出现了hMSCs或成纤维细胞这两种供体细胞的mtDNA，但没有检测到来自供体细胞的核DNA。这项研究结果提示线粒体的这种细胞间转运并不依赖于细胞融合。

隧道纳米管是Rustom等在鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞中发现的一种新的细胞间通信途径。2004年Rustom等[31]首次描述并将这种细胞间通信途径命名为隧道纳米管(tunneling nanotubes，TNT),扫描电镜下可见TNT是细胞间形成的一种膜状细胞桥，可直接连接相邻细胞。迄今为止，检测到TNT的细胞类型的数量在不断增加[32]，提示TNT可能是细胞间通信的一种普遍存在的机制。在不同类型的细胞中，TNT结构具有多样性，但又具有相似的特征；目前研究证实，TNT在数分钟内就可形成，直径50～200纳米，长度可达数个细胞直径，结构上有纤维状肌动蛋白(f-actin)而无微管[31]，为一种细胞向邻近细胞发出的突起，形态上类似于丝状物，可在离它们最近的距离上动态连接细胞。TNT已被证实可在细胞间转运多种细胞成分，如转移膜相关的细胞器、线粒体、溶酶体等[33～35]。

除了形成纳米管外，分泌微泡也被认为是线粒体跨细胞转运的重要机制之一。Islam等[18]将BMSCs灌注到肺组织的研究中发现，健康的BMSCs在附着于损伤的肺泡上皮后，形成了纳米管并释放出了微泡，且在这种微泡中检测到了源于BMSCs的正常线粒体，该研究认为BMSCs释放的微泡被上皮细胞吸收可能是导致线粒体跨细胞转运的原因之一。

先前的研究已经提出了隧道纳米管或其他细胞间连接的参与可能是外源性线粒体细胞间转运的机制，然而，植入孤立外源性线粒体的相关研究并不支持隧道纳米管是其进入细胞的机制。Masuzawa等[25]在心肌细胞周围植入自体线粒体后并没有观察到心肌细胞出现细胞延伸，表明通过隧道纳米管进行的线粒体吸收虽然在细胞间转移中表现出来，但可能不会在细胞器-细胞转移中发挥作用。孤立的外源线粒体被受体细胞吸收的机制可能是通过内吞作用的途径，2018年Robicsek等[22]对这种孤立的外源性线粒体进入细胞的机制进行了探讨，认为依赖于肌动蛋白的胞饮作用是最有可能的作用方式。细胞的大胞饮是一种细胞表面进行的内吞活动，可以通过吸收0.5～1 μm大小的细胞外颗粒来进行跨细胞交流[36，37]。目前这一机制的推测尚缺乏足够的证据，仍有待于进一步的研究来证实。

4 外源性线粒体植入治疗线粒体聋病的应用前景

线粒体基因和功能的异常可导致多种类型的感音神经性聋，迄今为止已有多种线粒体突变被证实是先天性聋和后天获得性聋的致病机制[38，39]。线粒体聋病可表现为伴有其他临床症状的综合征型耳聋和不伴有其他任何临床症状的非综合征型耳聋。由于耳蜗细胞线粒体是药物、缺氧、噪声等多种有害因素攻击的主要靶点之一，耳蜗细胞线粒体的功能障碍已被证实与药物性聋、噪声性聋等多种类型的感音神经性聋有关[38，40]。临床上常见的线粒体12SrRNA基因的A1555G突变和C1494T突变，即是氨基糖苷类抗生素致聋的常见病因。耳蜗细胞线粒体还与老年性聋密切相关，细胞衰老过程中mtDNA突变不断发生和积累，目前研究已在老年性聋的动物模型中验证了mtDNA缺失与年龄相关性耳聋之间具有明显相关性[41]。

迄今为止线粒体聋病尚缺乏有效的治疗方法。临床上主要通过对遗传性线粒体聋病患者进行产前基因检测和指导，避免携带有线粒体mtDNA致病突变的个体出生。然而，这种筛查涉及的突变位点有限，目前仅有C1494T突变和A1555G突变等少数线粒体突变位点可被检测[42]。先天性及后天获得性线粒体聋病一旦发生，便无法治愈，因此亟待寻找一种新的线粒体治疗方法纠正耳蜗细胞的线粒体功能、治疗线粒体聋病。目前外源性线粒体植入已在心血管系统、消化系统及神经系统疾病等动物模型上证实了治疗效果，如果外源性线粒体也能进入受损的耳蜗细胞并保持活性，进而使耳蜗细胞恢复线粒体功能，那么有望在治疗线粒体聋病方面取得突破性进展。

然而，外源性线粒体植入应用于在体的耳蜗细胞尚存在诸多问题，如：耳蜗位于颞骨深部，血供远不如心脏、肝脏及脑组织等丰富，通过静脉注射途径植入的外源性线粒体是否能够到达耳蜗细胞周围尚存在疑问，因此，圆窗给药或后半规管的局部注射可能是更适合耳蜗植入外源性线粒体的途径。同时，植入外源性线粒体也存在潜在的风险。在前述研究中植入有活性的外源性线粒体并未发现对细胞及机体造成负面影响，但植入的线粒体一旦失活则会引发机体的炎性损伤。2016年Wilkins等[43]将孤立的线粒体及分离出的线粒体DNA进行冰冻灭活，随后通过注射植入到C57BL/6小鼠的海马体内，7天后在海马体检测到了大量炎性标记物，研究发现这些失活的线粒体或线粒体成分可诱发神经炎症；因此，保证植入线粒体的完整性和活性十分关键。

尽管存在诸多风险和困难，外源性线粒体植入仍为线粒体病的治愈提供了一种新的独特的治疗策略，可从根本上纠正线粒体的遗传异常和功能缺陷，有望成为一种新的有效的治疗手段，与其他临床干预措施相结合或单独应用于线粒体聋病的治疗。