C11orf65、SLC47A1基因多态性与二甲双胍临床疗效的相关性分析

闵翼 许雄伟

【摘要】 目的：分析中國东南地区汉族2型糖尿病患者中，C11orf65、SLC47A1基因多态性与二甲双胍临床疗效的相关性。方法：对入组的110例初诊为2型糖尿病（T2DM）患者进行为期90 d的二甲双胍单药治疗，二甲双胍剂量根据患者血糖控制情况进行调整，初始剂量为500 mg/d，极量2 550 mg/d，每隔15天调整1次，完成全程治疗的有97例。采用荧光原位杂交法（FISH）对入组患者的血样进行C11orf65、SLC47A1基因型检测。观察二甲双胍给药前后患者的糖尿病各项疗效指标（FPG、HbA1c、HOMA-IR）的变化情况，比较C11orf65和SLC47A1不同基因型患者之间上述疗效指标变化情况是否存在差异。结果：二甲双胍单药治疗90 d后，SLC47A1各基因型之间FPG、HbA1c、HOMA-IR的变化无明显差异（P>0.05）;C11orf65 CC基因型患者的FPG降低值明显高于AA基因型患者（P<0.001），CC基因型患者的FPG降低值明显高于AC基因型患者（P=0.002）;CC基因型患者的HbA1c降低值明显高于AC、AA基因型患者（P<0.05）;CC基因型患者的HOMA-IR降低值明显高于AA、AC基因型患者（P=0.002，P=0.004）。结论：SLC47A1基因多态性对FPG、HbA1c、HOMA-IR的影响无明显差异，C11orf65 携带C等位基因比未携带者对空腹血糖的作用更好，CC基因型比AC基因型对HbA1c的作用更好，C11orf65携带C等位基因比未携带者的HOMA-IR降低得更多。

【关键词】 C11orf65 SLC47A1 二甲双胍 2型糖尿病 单核苷酸多态性（SNP）

[Abstract] Objective： To analyze the correlation between the gene polymorphism of C11orf65 and SLC47A1 and the clinical efficacy of Metformin in patients with type 2 diabetes mellitus of Han nationality in southeast China.Method： The 110 newly diagnosed patients with type 2 diabetes were treated with Metformin monotherapy for 90 days. The dose of Metformin was adjusted according to the patients blood glucose control. The initial dose was 500 mg/d and the maximum dose was 2 500 mg/d. A total of 97 patients completed the whole course of treatment. Fluorescence in situ hybridization （FISH） was used to sequence the polymorphisms of SLC47A1 and C11orf65 gene loci in the enrolled patients.The changes of various indicators of diabetes before and after Metformin administration between different genotypes of C11orf65 and SLC47A1 were compared. Result： There was no significant difference in FPG， HbA1c， HOMA-IR between SLC47A1 genotypes （P>0.05）.After 90 days of Metformin treatment， FPG decreased significantly in patients with CC genotype C11orf65 compared with patients with AA genotype （P<0.001）， and FPG decreased significantly in patients with CC genotype compared with patients with AC genotype （P=0.002）.The decrease of HbA1c in CC genotype patients was significantly higher than that in AC and AA genotype patients （P<0.05）. The decrease value of HOMA-IR in patients with CC genotype was significantly higher than that in patients with AA and AC genotype （P=0.002， P=0.004）. Conclusion： The effect of SLC47A1 gene polymorphism on FPG， HbA1c， HOMA-IR after 90 days of Metformin treatment is not different. C11orf65 with C allele has a better effect on fasting blood glucose than that without C allele. The effect of CC genotype on HbA1c is better than that of AC genotype.C11orf65 with C allele has a better effect on the reduction of HOMA-IR than that without carrier.

[Key words] C11orf65 SLC47A1 Metformin Type 2 diabetes Single nucleotide polymorphism（SNP）

First-authors address： Nanping First Hospital Affiliated to Fujian Medical University， Nanping 353000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.31.016

临床上二甲双胍的疗效存在明显的个体差异，这种差异与多种因素有关，其中遗传因素是决定性因素[1]，但其机制尚不清楚，可能与药物代谢酶、药物转运体、药物作用靶点等相关基因的多态性有关。SLC47A1（rs2289669G>A）基因位于第17号染色体短臂1区1带第2亚带，主要编码多药及毒素外排蛋白1（MATE1）[2-3]。MATE1在介导有机阳离子（包括药物、毒物和内源性代谢产物）的转运过程中发挥重要作用，包括将底物泵出细胞，转运至胆管或随尿液排出，从而降低底物在肝脏和肾脏细胞内的浓度[4-5]。二甲双胍就是其代表性底物。研究发现SLC47A1基因多态性会影响MATE1转运功能[6]，会影响底物的药动学和药效学，同时它可能与2型糖尿病患者经二甲双胍治疗后糖化血红蛋白（HbAlc）的降低有关[7-9]。韦娜等[10]2018年进行meta分析，共纳入6个研究，共880例研究对象，最后的结论认为2型糖尿病患者SLC47A1基因多态性对二甲双胍的疗效有显著影响，SLC47A1基因多态性检测可以作为二甲双胍疗效的预测手段。但是，也有研究报道SLC47A1多态性对二甲双胍疗效并无影响[11]。因此SLC47A1多态性是否对二甲双胍疗效和不良反应产生影响尚存在争议，本研究拟通过实验进行进一步确认。C11orf65（rs11212617 C>A）基因位于11号染色体第65个开放阅读框，一般认为它是影响二甲双胍降血糖反应的关键基因。二甲双胍主要通过抑制线粒体呼吸链复合体，活化AMP蛋白激酶（AMPK），增加细胞内AMP来改善空腹血糖水平。AMPK通路的激活被认为是二甲双胍抑制肝糖异生的重要基础机制。Zhou等[12]认为C11orf65基因参与DNA修复和细胞周期调控，在AMP活化蛋白激酶上游发挥调控二甲双胍的作用，该基因的变异改变了二甲双胍的降血糖反应。Leeuwen等[13]通过meta分析，探讨C11orf65不同基因型是否影响二甲双胍治疗后糖化血红蛋白下降和达标的能力，发现C11orf65基因多态性与糖化血红蛋白下降的关系不显著。Florez等[14]研究发现C11orf65 基因多态性与前期患者的糖尿病发病率并无关系，而与二甲双胍治疗效果有关。这两项研究的样本均来自英国，目前对中国汉族人群研究较少。而且，关于C11orf65基因多态性是否影响二甲双胍疗效存在矛盾报道，尚待进一步明确，以便更好指导临床个体化治疗。

总之，目前在2型糖尿病（T2DM）患者中，关于SLC47A1、C11orf65的基因多态性与二甲双胍临床疗效之间的相关性研究不多，研究结果也不一致，故本研究拟通过分子遗传学的方法分析SLC47A1、C11orf65基因多态性与二甲双胍疗效的相关性，以期找到明确预测有效性的遗传标记，从而指导临床个体化治疗，最终达到提高血糖达标率，减少医疗费用的目的，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 生理盐水（湖北兴华制药有限公司）;灭菌等离子水（实验室自制）;DNA提取液10%NH4CL（北京华夏时代基因科技發展有限公司）;DNA保存液（耀金保：北京华夏时代基因科技发展有限公司）;测序反应通用试剂盒（耀金分：北京华夏时代基因科技发展有限公司）;葡萄糖测定试剂盒（安徽大千生物工程有限公司）;胰岛素测定试剂盒（美国西门子）;糖化血红蛋白A1c检测试剂盒（Bio-Rad Laboratories，Inc.）。

1.2 主要仪器 涡旋混匀仪（江苏康健医疗用品有限公司，XH-D）;高速离心机 （安徽中科中佳科学仪器有限公司，HC-2516）;掌上离心机（其林贝尔仪器制造有限公司，LX-400）;实时荧光定量PCR仪（西安天隆科技有限公司，RT-CyclerTM436/TL998A）;离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司，KDC-1042）;全自动化学发光免疫分析系统（美国西门子，ADVIA Centaur XP）;全自动血红蛋白测试系统（Bio-Rad Laboratories，Inc.，ARIANT II）;全自动血液分析仪（sysmex株式会，XN 9000）。

1.3 方法

1.3.1 临床试验对象 试验对象为2018年1月-2019年2月初诊于本院的110例2型糖尿病（T2DM）患者，男50例，女47例;年龄20～75岁，平均（58.2±14.0）岁。所有受试者均为中国东南地区汉族人，个体间无亲缘关系，所有受试者均签署知情同意书。

1.3.2 入组标准 （1）符合1999年WHO糖尿病诊断标准的初诊2型糖尿病患者，即糖尿病症状（多饮、多尿、多食、体质量下降），加上随机血糖检测≥11.1 mmol;FPG（空腹血糖）≥7.0 mmol/L;或者加上糖负荷后2 h血糖检测≥11.1 mmol。任意满足其中一个条件并且重复证实，诊断成立。（2）年龄大于16周岁。（3）空腹血糖介于7.0～18.0 mmol/L。（4）身高体重指数（BMI）18.5～27.5 kg/m2。（5）最近15 d无口服降糖药物或者胰岛素治疗史。

1.3.3 排除标准 （1）肾功能不全[血肌酐水平男性>132.6 μmol/L（1.5 mg/dL），女性>123.8 μmol/L（1.4 mg/dL）或预估肾小球滤过率（GFR）<45 mL/min]、肝功能不全、严重感染、缺氧或接受大手术的患者、糖尿病高渗性昏迷、酮症酸中毒、严重心血管疾病;（2）急性或慢性心功能不全者;血液疾病;（3）怀孕和哺乳期妇女;（4）嗜酒者。

1.3.4 中止实验标准 （1）患者服药过程中如出现血乳酸增高>3 mmol/L，尿酮体、血肌酐>120 mmol/L，尿酮阳性应立即停药，根据医生判断应该停止临床试验者。（2）患者出现心绞痛，心肌梗死，间歇性跛行，以及败血症，心、肺和肝、肾功能恶化时均应停药。（3）患者依从性差，漏服药物累计10 d或者10 d以上。（4）受试者在临床实验过程中由于个人原因主动向医生提出中止。（5）其他原因。

1.3.5 给药方案 服用盐酸二甲双胍片（格华止，生产厂家：中美上海施贵宝制药有限公司，批准文号：H20023370，规格：0.5 g*20 s），研究观察疗程为90 d。监测治疗前后空腹血糖、空腹胰岛素，糖化血红蛋白，避免饮酒。每隔15天调整一次药物剂量：若患者FPG≥7 mmol/L，500 mg/d或750 mg/d则剂量加倍，1 000 mg/d则加至1 500 mg/d，最大剂量为2 500 mg/d;若FPG<7.0 mmol/L，继续维持该剂量直至随访结束。如果服药期间发生了与二甲双胍有关的胃肠道等不良反应并且在服药4～10 d后仍未改善，可酌情将其剂量下调或停药。

1.3.6 SLC47A1、C11orf65基因多态性检测 采用2 mL EDTA抗凝管进行受试者静脉血的收集。 SLC47A1、C11orf65基因型检测采用国家卫生健康委员会《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南（试行）》中推荐的9种测序方法之一的荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）法。

1.4 统计学处理 使用SPSS 22.0統计学软件进行分析，计量资料符合正态分布采用（x±s）表示，比较采用配对t检验;计量资料符合偏态分布采用中位数四分位数间距进行描述，组间比较采用Kruskal-Wallis H验比较偏态分布计量资料的组间差异，组内比较采用Wilcoxon检验。计数资料采用率（%）表示，组间比较采用字2检验。采用多重线性回归调整年龄、性别、BMI和药物剂量，并采用方差分析比较初始的和用线性回归预测的ΔFPG、ΔHbA1c、ΔHOMA-IR差异，采用LSD法两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

本研究共有110例患者入选完成了基线特征调查，8例因不良反应退出研究，5例依从性差，累积漏服药物10 d以上，97例患者完成3个月的最终随访。97例研究对象均为东南地区汉族人群，平均年龄（58.2±14.0）岁，男50例（51.5%），女47例（48.5%），BMI（24.4±3.3）kg/m2。

2.1 基因位点的基因分型和等位基因频率 中国汉族T2DM患者人群中SLC47A1与C11orf65位点的等位基因频率分布服从Hardy-Weinberg遗传平衡定律，提示所选人群具有较好的群体代表性。见表1。

2.2 SLC47A1、C11orf65不同基因型基本特征比较 治疗前不同基因型组之间，患者性别、年龄、BMI指数比较差异均无统计学意义（P>0.05）。对SLC47A1和C11orf65不同基因型组的受试者进行人口社学会学特征的比较，不同基因组之间的性别、年龄、BMI指数比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2、3。

2.3 SLC47A1、C11orf65 不同基因型间二甲双胍临床疗效的比较

2.3.1 SLC47A1不同基因型与二甲双胍临床疗效的关联 调整性别、年龄、BMI和用药剂量后，ΔFPG、ΔHbA1c、ΔHOMA-IR之间的差异比较均无统计学意义（P>0.05）。见表4。

2.3.2 C11orf65不同基因型与二甲双胍临床疗效的关联 调整性别、年龄、BMI和用药剂量后，发现AA基因型比CC基因型的ΔFPG低（P<0.001），AC基因型比CC基因型的ΔFPG低（P=0.002），AC基因型比CC基因型的ΔHbA1c低（P=0.048），AA基因型比CC基因型的ΔHOMA-IR低（P=0.002），AC基因型比CC基因型的ΔHOMA-IR低（P=0.004）。其他基因型ΔFPG、ΔHbA1c、ΔHOMA-IR之间的差异均无统计学意义（P>0.05）。见表5。

3 讨论

本研究显示，SLC47A1基因多态性对FPG、HbA1c、HOMA-IR的影响无明显差异，C11orf65 携带C等位基因比未携带者对空腹血糖的作用更好，CC基因型比AC基因型对HbA1c的作用更好，C11orf65携带C等位基因比未携带者的HOMA-IR降低得更多。

97例T2DM患者中，C11orf65基因型分布频数：CC（47.4%）、AC（38.2%）、AA（14.4%）;SLC47A1基因型分布频数：AA（22.7%）、GA（55.7%）、GG（21.6%）。本次实验得到的中国东南地区汉族T2DM患者SLC47A1、C11orf65等位基因频率分布与2014年陈培贤[2]公布的中国汉族人群的基因频率不一致。他们公布的C11orf65基因型分布频数：CC（30.5%）、AC（52.4%）、AA（17.1%）;SLC47A1基因型分布频数： AA（6.1%）、GA（79.3%）、GG（14.6%）。基因频率分布不同的可能原因是地区差异，但目前的研究相对较少，且样本量较小，还需要进一步扩大样本量。

SLC47A1编码的多药毒素挤压转运蛋白1 （MATE1）定位于肾小管细胞刷状缘膜，与OCT2共同介导二甲双胍从血到尿的清除[15]。SLC47A1基因的某些变异可能影响二甲双胍的分布和清除。文献[9]报道，与G等位基因携带者相比，SLC47A1 A等位基因纯合子携带者在接受二甲双胍治疗6个月后，糖化血红蛋白含量显著降低。也就是说，20%的2型糖尿病患者糖化血红蛋白的降低比其余患者高0.55%（即降低2倍）。有研究认为，SLC47A1基因多态性与二甲双胍单药治疗90 d以后的糖化血红蛋白水平变化情况无影响[2]。本次研究中通过二甲双胍单药治疗90 d后，观察T2DM患者治疗前、治疗后的各血糖指标变化情况，对数据进行整理分析后发现携带A等位基因比未携带A等位基因的基因型C肽增加更多（P=0.010），提示胰岛β细胞分泌胰岛素的功能恢复得更好。FPG、HbA1c、HOMA-IR的变化差异在各个基因型之间无统计学意义（P>0.05），与Tká?等[9]研究的结论不一致，与陈培贤[2]研究结论部分一致，SLC47A1基因多态性对FPG、糖化血红蛋白的影响一致，均认为SLC47A1对上述T2DM的血糖指标影响不显著，差异无统计学意义（P>0.05）;但对胰岛素抵抗指数的影响，观点不一致，前者认为SLC47A1基因多态性与二甲双胍单一药物治疗后HOMA-IR变化有关，SLC47A1 AG基因型比GG/AA基因型胰岛素抵抗指数增加幅度更多[2]。本实验研究发现治疗前后的HOMA-IR变化与SLC47A1 基因多态性无关。

有研究指出中国人群中C11orf65基因多态性与二甲双胍的疗效有关，带有A等位基因的患者疗效优于不带有A等位基因患者[16]。另一项研究认为C11orf65基因多态性与二甲双胍治疗后FPG水平变化有关联，AC基因型对二甲双胍降糖更有效，同时还提示该位点与二甲双胍治疗后β细胞功能指数水平变化有关，AC基因型对二甲双胍治疗后β细胞功能指数影响更大[2]。本研究通过调整性别、年龄、BMI和用药剂量等变量后，发现C11orf65 CC基因型比AA基因型降低FBG值更多（P<0.001），CC基因型比AC基因型降低FBG值更多（P=0.002），即携带A等位基因的基因型比不携带A等位基因的降低空腹血糖效果差;发现CC基因型比AC基因型降低HbA1c更多（P=0.048）;CC基因型降低HOMA-IR比AA基因型多（P=0.002），CC基因型降低HOMA-IR比AC基因型更多（P=0.004）。结果与上述研究结论部分一致，可能与种族、人群、样本量等有关，有的研究样本偏小，可能影响实验结果。同是中国汉族人群，地区差异可能会导致等位基因頻率的差异，也会影响到最终结果。研究发现，针对中国人群的研究，样本量都较小，且研究不多，因而研究结果还需要通过扩大样本量或采取多中心研究进一步验证。

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（收稿日期：2019-09-24） （本文编辑：周亚杰）