多色探针熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药性检测中的应用

蔚鸣 许鑫鑫 闫朋 张宝庆 刘春涛 吴景秋 刘玉琴 王开利 侯艳杰

根据世界卫生组织(WHO)2018年报告，2017年全球估算耐多药/利福平耐药结核病(MDR/RR-TB)患者为55.8万例，仅有约25%的患者接受检测和治疗。因单一结核病死亡130万例，结核病仍然是高于艾滋病在内的传染病中的“头号杀手”。估算中国MDR/RR-TB患者5.8万例,居世界第二位，是全球结核病第二高负担国家[1]；MDR/RR-TB患者纳入治疗率为22.5%，可见，MDR/RR-TB患者的诊治缺口巨大。结核病中95%为肺结核[2]，其传播方式为飞沫传播，已证明传播是导致耐多药结核病疫情上升的主要原因[3]。因此迫切需要简便、快速、敏感、特异、准确的诊断活动性结核病和耐药结核病的方法，对快速提高结核病的发现率及病原学阳性检出率，早期诊治及规范化管理，快速筛查MDR/RR-TB、提高其治愈率及有效控制其传播将发挥重要作用。

目前，结核分枝杆菌MTB比例法药敏试验是耐药性检测的金标准，但是检测报告时限长，在4～8周不等，严重制约耐药结核病患者的早发现、早诊断、早隔离的管理措施。WHO推荐的GeneXpert MTB/RIF及线性探针检测技术(LPAs)存在仪器价格昂贵、试剂成本高及检测药物仅为一线抗结核药物等问题。我国自主研发的获多项专利技术的多色探针熔解曲线分析法(multicolor melting curve analysis，MMCA)MTB耐药性检测技术，是建立在野生型DNA分子和突变型DNA分子的GC含量不同的基础之上，在PCR体系中加入两端分别标记有荧光基团与淬灭基团的探针，在PCR过程中扩增处于探针序列互补的单链核苷酸序列，在扩增完成后增加熔解曲线分析过程，同时实时监测荧光值的变化，通过计算荧光值与温度的负导数，可获得探针与该序列杂交产物的熔解曲线，并得出熔点(Tm值)，从而推得该序列突变信息[4]。该方法能够检测四种一线抗结核药物及二线氟喹诺酮类(FQ)药物，且操作简便，报告时间3～4 h，表现出很高的敏感度和特异度。已发表文献中多是关于该方法对利福平(RFP)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、左氧氟沙星(Lfx)耐药性检测与比例法药敏试验比对的报道，但是未见有该方法对莫西沙星(Mfx)耐药性检测与比例法及基因测序比对的报道，有必要对其在应用中做进一步的研究和验证，从而对MDR-TB患者个体化治疗提供依据。本研究对同一患者的晨痰采用BACTEC MGIT 960培养后，采用比例法与MMCA法同时检测5种抗结核药物的耐药性，对两方法检测结果不一致的标本再采用分辨率最高、结果最为可靠的参考标准——基因测序法验证，最终评价MMCA检测在耐药结核病快速诊断中的临床应用价值。

资料和方法

一、研究对象

本研究为黑龙江省传染病防治院结核病实验室临床标本检测结果的回顾性分析。以2016年1月至2016年12月于内科住院且依据《肺结核诊断标准(WS288—2008)》[5]确诊、依据《WS 196—2001结核病分类标准》[6]分类的继发性肺结核患者，且痰抗酸杆菌显微镜检查和(或)MTB核酸分子检测阳性的235例继发性肺结核患者作为研究对象，同时将痰液(合格晨痰)MMCA检测与BACTEC MGIT 960培养分离株比例法药物敏感性试验(简称“药敏试验”)进行比对分析。235例患者中，男162例(68.94%)，女73例(31.06%)，年龄12～81岁，平均(43.6±16.5)岁。

二、主要试剂与仪器

痰抗酸杆菌显微镜检查采用荧光染色显微镜检查法，金胺“O”染色液购自珠海贝索生物技术有限公司；分枝杆菌液体培养采用BACTEC MGIT 960操作系统，由美国BD公司提供；分枝杆菌菌种鉴定采用MTB抗原检测试剂盒(胶体金法)，购自杭州创新生物检控技术有限公司；固体药敏试验(比例法)含药培养管购自珠海贝索生物技术有限公司，其中Mfx浓度为2 mg/L[7]。MTBRFP、INH、EMB、FQ耐药检测试剂盒(荧光PCR熔解曲线法)、标本基因测序结果、Lab-Aid 824全自动核酸提取仪、SLAN-96S全自动医用PCR分析系统等由厦门致善生物科技有限公司提供。

三、试验方法

1．痰抗酸杆菌显微镜检查、分枝杆菌液体培养、菌种鉴定、比例法药敏试验遵照《结核病实验室检验规程》[4]中的标准操作程序执行，4项检测方法室间质量评价和室内质量控制合格。

2．MMCA方法：(1)MMCA检测RFP、INH、EMB、FQ耐药基因突变情况。RFP检测区域为rpoB基因507～533共27个氨基酸密码子区域内[利福平耐药决定区(RRDR)81 bp的突变情况]；INH检测区域为ahpC启动子区(-44～-30以及-15～3位点)、inhA94密码子、inhA启动子区(-17～-8位点)以及katG315密码子的突变情况；EMB检测区域为embB基因306位密码子、406位密码子、497位密码子的突变情况；FQ检测区域为gyrA基因88～94位密码子的突变情况。(2)MMCA检测方法与结果判断。严格执行RFP、INH、EMB、FQ耐药性检测试剂盒说明书的标准操作规程，按照Lab-Aid 824全自动核酸提取试剂盒说明书操作，在Lab-Aid 824全自动核酸提取仪上自动提取，收集模板备用。结果判定：当标本与阳性对照Tm值一致(误差<1 ℃)时判定为野生型，△Tm值≥2 ℃时判定为突变型，提示该菌株对此药物耐药，△Tm值以仪器自动判读为准。严格按照说明书要求进行批内质量控制、室内质控及室间质评。

3．基因测序：采用双脱氧核苷酸末端终止法(Sanger法)，测序引物RFP-F GGGAGCGGATGACCACCCA、RFP-R GCGGTACGGCGTTTCG-ATGAAC；INHKatG-F CGAGACGTTTCGGCGCATG、KatG-R CCGTCCTTGGCGGTGTATTG、InhA-17～-8-F ACATACCTGCTGCGCAATTC、InhA-17～-8-R CCGATCCCCCGGTTTCCTC、InhA94-F CGTTTCACATCGCACGGGTAG、InhA94-R CGAGATGTGGATGCCCTTGGAC、AhpC-FCTTGCCGGAAAGACATGCCCAhpC-RCTGGTGA-TAGTGGTGAAGTAGT；EmbB406/497 F CCA-GCAAACCCGCCTACT、EmbB406/497 R CATAGCGCGGTGATCAAAAAGC、EmbB306-406 F AGGCCGTTCCGGCCTGCATCGTCG、EmbB306-406 R GTGTGAGCCGGCTGTACCGCATGGACC；FQ-F GACCGCAGCCACGCCAAG、FQ-R AGCATCACCATCGCCAACG；对MMCA法与比例法药敏试验检测结果不一致标本，分别进行基因测序法验证比对。

四、统计学处理

1．收集资料及方法：本研究收集MMCA法、比例法、基因测序法在痰标本及MTB分离株中对RFP、INH、EMB、Lfx、Mfx 5种抗结核药物耐药性检测结果，由双人同时录入Excel，并经一致性检查，修正错误录入的数据后，建立数据库。

2．各指标计算方法：敏感度=真阳性数/(真阳性数+假阴性数)×100%=a/(a+c)%；特异度=真阴性数/(真阴性数+假阳性数)×100%=d/(b+d)×100%；准确度=(真阳性数+真阴性数)/(真阳性数+真阴性数+假阳性数+假阴性数)×100%=(a+d)/(a+b+c+d)%；阳性预测值=真阳性数/(真阳性数+假阳性数)×100%=a/(a+b)×100%；阴性预测值=真阴性数/(真阴性数+假阴性数)×100%=d/(c+d)×100%；约登指数=敏感度+特异度-1。

3．统计学处理：采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，MMCA法耐药检测结果与金标准比例法药敏试验进行一致性检验(Kappa检验)，K≤0.40时,表明一致性较差；0.400.80认为两者一致性极好。

结 果

一、MMCA法与比例法耐药检测结果比较

在235例痰标本中，以比例法药敏试验结果为金标准，MMCA法在RFP、INH、EMB、Lfx、Mfx 5种抗结核药物及在MDR-TB中进行耐药性检测的敏感度分别为94.64%(106/112)、88.39%(99/112)、73.08%(19/26)、92.65%(63/68)、87.50%(21/24)、84.71%(72/85)；特异度分别为93.50% (115/123)、92.68%(114/123)、 80.86% (169/209)、95.81%(160/167)、76.78% (162/211)、92.00%(138/150)；上述6种情况符合率分别为94.04%(221/235)、90.64%(213/235)、80.00%(188/235)、94.89%(223/235)、77.87%(183/235)、89.36% (210/235)；约登指数分别为0.8814、0.8107、0.5394、0.8846、0.6428、0.7670。两种方法对RFP、INH、Lfx 3种药物耐药性检测结果一致性极好(K值分别为0.88、0.81、0.88)，对MDR-TB的一致性较高(K值为0.77)，对EMB、Mfx 2种药物耐药性检测结果一致性较差(K值分别为0.35、0.34)(表1)。

表1 235例晨痰标本MMCA检测与235例MTB分离株比例法药敏试验比对情况

注敏感度=真阳性数/(真阳性数+假阴性数)×100%=a/(a+c)%；特异度=真阴性数/(真阴性数+假阳性数)×100%=d/(b+d)×100%；准确度=(真阳性数+真阴性数)/(真阳性数+真阴性数+假阳性数+假阴性数)×100%=(a+d)/(a+b+c+d)%；阳性预测值=真阳性数/(真阳性数+假阳性数)×100%=a/(a+b)×100%；阴性预测值=真阴性数/(真阴性数+假阴性数)×100%=d/(c+d)×100%；约登指数=敏感度+特异度-1

二、MMCA法与比例法检测结果不一致标本的MMCA法与基因测序结果比较

两种方法对5种抗结核药物检测结果不一致的标本共计147例，分别进行MMCA法和基因测序法检测结果的比对。在痰液标本中MMCA法与基因测序法检测结果不一致标本15例，符合率达89.80%(132/147)；在培养后MTB分离株标本中，MMCA法与基因测序法检测结果不一致标本仅有2例，符合率达98.64%(145/147)。在MMCA法与比例法药敏试验符合率不理想的EMB和Mfx两种药物中，MMCA检测结果与基因测序法的结果符合率，在痰标本检测中分别为93.62%、96.00%；分离株标本中分别为97.89%、98.00%(表2，3)。

表2 147例比例法药敏试验与MMCA法检测结果不一致标本进行MMCA法与基因测序结果比较

表3 5种药物147例比例法药敏试验与MMCA检测结果不一致分布情况

注a：在比例法药敏试验检测为耐药而MMCA检测为敏感的7份标本中，有1份经基因测序结果显示为耐药；b：在比例法药敏试验检测为耐药而MMCA检测为敏感的3份标本中，有1份经基因测序结果显示为异质性耐药

讨 论

MTB产生耐药性的主要机制是基因突变。关键基因位点的突变会导致MTB耐药性的产生，如rpoB、katG、embB、gyrA基因一些位点突变分别与RFP、INH、EMB、FQ类药物耐药性的产生相关[4]。当这些基因突变在耐药株中占有较大比率时，则可以用分子生物学的方法通过检测基因突变来判断MTB对药物的耐药性，这类检测称为分子耐药性检测。但分子耐药性检测与表型药敏试验并非完全一致，分子耐药性检测的准确性由耐药基因突变及耐药性的关联程度决定[8]。目前，基于MTB突变基因位点检测有多种方法，如测序法(其他鉴定技术的参考标准)、线性探针法、MMCA法以及基因芯片技术等，本研究通过对235例痰标本MMCA法与比例法药敏试验比对评价其临床应用效能。

MMCA法对RFP、INH、Lfx、MDR-TB耐药性检测的敏感度分别为94.64% (106/112)、88.39%(99/112)、92.65%(63/68)、84.71%(72/85), 特异度分别为93.50% (115/123)、92.68(114/123)、95.81%(160/167)、92.00% (138/150)，Kappa检验K值分别为0.88、0.81、0.88、0.77，显示MMCA法与金标准比例法药敏试验具有极好的一致性，与文献[9-10，11-14]报道相符；对EMB耐药性检测的敏感度、特异度、准确度分别为73.08%(19/26)、80.86%(169/209)、80.00%(188/235)，与严虹等[15]报道相似，Mfx未见报道。

5种药物2种方法检测结果不一致的标本共计147份，经基因测序技术验证，痰液及培养分离株2种标本进行MMCA检测结果与基因测序结果的总符合率分别为89.80%、98.64%；MMCA与比例法药敏试验检测结果符合率不理想的对EMB、Mfx的耐药性检测也同样是MMCA和基因测序结果的符合率高(表2)，在痰标本中分别为93.62%、96.00%；分离株标本中分别为97.89%、98.00%。

日常工作中痰液标本的MMCA与比例法药敏试验检测结果不一致的原因：首先，MTB表型药敏试验作为金标准，但也有其方法学局限性。对RFP和INH的药敏试验结果具有较高的可靠性和临床价值，而EMB则较差[16]。而分子耐药性检测方法是基于MTB的基因位点突变来判断对RFP是否耐药，当耐药临界点浓度为40 mg/L时区分能力为85.8%，有14.2%的菌株被误判为敏感株或耐药株[16]；正如WHO 2014年版《耐药结核病规划管理指南手册》[17]所述：MTB对RFP耐药定义为表型或基因型药敏试验发现RFP耐药，一旦分子生物学方法发现RFP耐药基因突变，无论表型药敏试验结果如何，需要考虑为耐药结核病的可能。

INH耐药临界点浓度为0.2 mg/L(能最大程度地区分敏感株和耐药株)时区分能力为75.8%,有11.1%的耐药株误判为敏感株、13.1%的敏感株误判为耐药株[16]；而MMCA检测的基因位点是目前覆盖耐药位点最多的检测方法，但MTB耐INH的机制比较复杂，有待进一步研究。

EMB耐药临界点浓度为2 mg/L，表型药敏试验不能有效区分耐药菌株或敏感菌株，其误判率更高[16]；因此，EMB 在MMCA检测结果与比例法药敏试验结果的比对分析中，比例法已失去其金标准的价值，导致MMCA阳性预测值为32.2%、Kappa检验K值为0.35；2种方法检测结果不一致的47例进行基因测序，痰液和分离株标本采用MMCA与基因测序结果的符合率分别为93.62%(44/47)、97.87%(46/47)，优于表型药敏试验。基因测序中发现2例试剂盒检测位点范围之外突变，分别为454GCG>GTG、504GCC>ACC，目前未见文献报道该突变是否会引起对EMB耐药，但是本研究中该2例采用比例法药敏试验结果均为耐药，与基因测序一致。表3数据显示，分子药敏试验对耐药的发现率为76.87%(113/147)、表型药敏试验对耐药的发现率为23.13%(34/147)，说明随着分子诊断技术的应用推广，势必大幅度提高耐药结核病的发现率。

FQ类药物主要作用于MTB的DNA拓扑异构酶，具有类似的耐药机制，有明显的交叉耐药现象，但对第二、三代FQ类药物耐药的菌株可能对第四代FQ类药物敏感，而且与该类药物作用时间和频度密切相关[18]。本研究中，对Lfx、Mfx检测的敏感度和特异度分别为92.65% (63/68)、95.81% (160/167)，87.50% (21/24)、76.78% (162/211)；Kappa值分别为0.88、0.35；阳性预测值分别为90.00% (63/70)、30.00% (21/70)；提示Lfx在2种方法中一致性极好，与李国利等[12]报道一致；在对Mfx的检测中一致性较差，其比例法与MMCA比对未见报道。文献报道，鉴于FQ类药物中不同药物的耐药性差异很大，建议应开展FQ类药物的药敏试验，根据药敏试验的结果选药[16]。上述差异，笔者认为主要是由于先前界定的Mfx耐药临界点浓度为2 mg/L[7]，而2018年 WHO新修订的标准为1 mg/L[19],会将比例法一部分原本耐药的菌株判为敏感。本研究中，比例法药敏试验结果敏感而MMCA检测结果耐药的有49例，占2种方法不一致的94.23%(49/52)也充分显示了存在上述问题；另外也存在本院结核病患者大部分来自于农村，以往使用Lfx者比较普遍，而Mfx的使用频数低，从而2种药物的耐药率差异较大。因此，加强对FQ类药物临床使用的管理，以有效减少此类药物耐药性的产生[18]。再有应该对FQ类药物分子水平耐药机制及耐药位点做深入研究，旨在发现FQ类药物中不同品种药物耐药机制的差异，对临床个体用药将具有重要的指导价值。

MDR-TB中，通过MMAC法检测为MDR-TB而比例法药敏试验未检出的12例中，MMAC法与基因测序结果全部一致，其敏感度为84.71%(72/85)，与Pang 等[13]的报道相似；但特异度为92.00% (138/150)，优于Pang 等[13]的报道。

另外，还有以下几种原因导致痰标本的MMCA检测结果与比例法药敏试验不一致：(1)当痰标本中MTB量低于MMCA检测下限时，使个别痰液标本表型药敏试验为耐药而分子耐药性检测为敏感，与测序结果不一致,表2中RFP和INH分别有2例EMB有1例为此种情况，这类患者在评价临床疗效不理想时，一定密切关注后续的表型药敏试验结果，实时调整个体化治疗方案。因此，临床工作中发挥分子耐药性检测早期快速筛查的优势，待表型药敏试验报告结果后，结合临床疗效综合分析，及时调整优化方案。(2)柳清云等[20]所述异质性耐药,是指在同一标本中同时存在耐药菌和敏感菌的现象,这体现了细菌群体从部分耐药向完全耐药转变的过程；本研究在147例中有9例，占6.12%(9/147)经测序和(或)MMCA检测证实为异质性性耐药。高旭等[21]报道，异质性耐药是导致表型和基因型耐药性检测结果不符的重要原因，为排除异质性耐药对耐药基因检测的影响,提高基因型与表型耐药性检测结果的一致性,需要开发应用更敏感的基因型耐药检测技术,以提高耐药结核病快速检测水平，除基因测序外MMCA是目前惟一可以检测异质性耐药的的新技术。 (3)在对RFP的耐药性检测中，痰液标本MMCA检测结果与基因测序不一致者有4例，其中2例为MMCA检测中△Tm值分别为1.3 ℃和1.7 ℃，按MMCA说明书△Tm>2.0 ℃判定标准判为敏感，而测序结果分别为516 GAC→GGC、531TCG→TTG突变，目前MMCA自动判读软件已升级，有效避免了此类突变的漏报，操作者也应在△Tm值在1.5 ℃左右时，仔细分析曲线，必要时做该标本的基因测序，以验证MMCA检测结果的准确性。(4)尽管笔者收集了痰抗酸杆菌显微镜检查和(或)MTB核酸分子检测阳性患者的合格晨痰，即便如此，由于DNA提取过程中的损耗，以及标本扩增的效率等问题[6]，仍然会有个别标本出现未知的扩增抑制而使2种方法的检测结果不一致。(5)本研究对RFP进行比例法药敏试验耐药而MMCA耐药性检测敏感的6例中，有2例△Tm值分别为1.3 ℃和1.7 ℃而报告为敏感；4例为MMCA法检测结果与基因测序一致，该患者为MDR-TB患者，可能存在MTB细胞壁增厚、产生药物外排泵、产生药物水解酶等其他耐药机制引起的耐药。

本研究痰液、分离株MMCA与测序方法比对平均符合率分别为89.80%(132/147)、98.64%(145/147)，二者有一定差异，与某些痰液原始标本载量低于MMCA检测下限时易出现漏检有关，文中有8例痰液[3.4%(8/235)]MMCA与基因测序结果不一致；而当标本经培养富集后，MMCA与测序法一致性很好；极少数痰液受诸如食物残渣等杂质或者未知成分的影响，使DNA提取过程损耗，以及出现标本扩增的效率、扩增抑制等问题[4]；北方干燥季节及由某种病原体感染引起的重度黏稠的痰液不易液化会引起漏检耐药结核病；异质性耐药也是其中一个影响因素。但尽管如此，也要遵循WHO及《十三五全国结核病防治规划》中要求的快速筛查耐药结核病，采用痰液直接进行分子药敏检测，快速诊治MDR-TB，后续再结合临床疗效及比例法药敏试验结果综合评价，调整患者个体化治疗方案。

综上所述，痰液MMCA法直接检测患者MTB耐药情况,与金标准比例法药敏试验及参考方法基因测序技术一致性好，速度快，敏感度高、可重复性好，以及结果易判读[22]、覆盖耐药位点多、闭管式操作可大大降低PCR产物污染的风险等特点，显示其对耐药MTB的快速检测是有效、可行的，在结核病特别是耐药结核病早发现、早诊断、早干预、控制传播、保护易感人群方面将发挥重要作用。

志谢深圳市龙华区慢性病防治中心房宏霞老师对本研究统计学方面给予了大力支持和帮助！