L-肉碱对胖头鱥肌肉细胞和草鱼性腺细胞抗氧化功能的调节作用

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(1.吉林农业大学 动物科学技术学院，吉林 长春 130118； 2.吉林省水产技术推广站，吉林 长春 130012；3.通化师范学院，吉林 通化 134000)

氧化应激是指机体活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平过高，超出了抗氧化防御系统的清除能力，导致机体氧化物与抗氧化物不平衡的状态[1]。ROS主要来源于细胞线粒体呼吸链的电子泄露[2]。因此，一般能量代谢强度较大，线粒体呼吸作用活跃的组织容易发生电子泄露，如心肌、骨骼肌、性腺等都是ROS过量积累的场所[2-3]。氧化应激给人类健康和现代养殖业带来了巨大的危害。已有研究表明，细胞高水平的ROS与一些心脑血管疾病、神经性疾病，甚至癌症的发生密切相关，进而会诱发多种疾病，严重威胁着人类的健康[4-5]；氧化应激能够同时降低畜禽动物的采食量和饲料转化效率，降低动物对疾病的抵抗能力，诱导相关疾病的发生[6]。与畜禽动物相比，水产动物更容易受到氧化应激的影响，引发生长性能降低、脂肪酸组成改变及抵抗力下降[7-8]。

L-肉碱是一种易溶于水的维生素，其最重要的生理功能是携带长链脂肪酸进入线粒体，促进脂肪酸的β-氧化，为机体提供更多的三磷酸腺苷酶(ATP)[9]。近年来，L-肉碱的抗氧化功能成为人类医学的研究热点。对L-肉碱在养殖动物抵抗氧化应激方面的研究尚处于起步阶段，尤其是在转录水平上，L-肉碱对水产动物影响的资料信息缺乏[10]。鱼类肌肉组织负责完成运动行为，而性腺则负责产生生殖细胞完成繁殖活动，这两种组织对能量的需求均较高，线粒体呼吸作用较强，ROS易过度积累而发生氧化应激。本研究中，在体外条件下，以胖头鱥肌肉细胞(Fathead minnow muscle cell line，FHM)和草鱼性腺细胞(Ctenopharyngodonidellusovary cell line，GCO)两种鲤科鱼细胞为研究对象，用不同浓度的L-肉碱作用细胞，探讨其对超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽连接酶(γ-GCS)等抗氧化酶活性及其基因相对表达量的影响，旨在为L-肉碱抗氧化作用机理的揭示及作为抗氧化剂应用于生产实践提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用胖头鱥肌肉细胞(FHM)和草鱼性腺细胞(GCO)购自天津市水产研究所。

试验试剂：细胞总RNA提取试剂RNAiso(D9108B)购自大连宝生物工程有限公司；PCR Master mix试剂盒(KT201)购自北京天根生化科技有限公司，反转录试剂盒(4368814)购自美国Invitrogen公司；SYBR Green 荧光定量PCR试剂盒(600830)购自美国安捷伦科技有限公司；SOD(A001-2-1)、CAT(A007-1-1)、GPX(A005)和γ-GCS(A091-1)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。胎牛血清(16000-044)和M199培养基 (11150-059)均购自美国Gibco公司。

试验仪器：梯度PCR仪 (Life Eco)为杭州博日科技有限公司产品，荧光定量PCR仪(StepOne TM)购自美国ABI公司，荧光倒置相差显微镜(CKX31-A12PHP)购自日本Olympus公司，722型可见分光光度计购自北京鑫润科诺仪器仪表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 经复苏后的FHM和GCO细胞在含有10%胎牛血清和M199完全培养基(青霉素100万单位/mL，链霉素100万单位/mL)的恒温培养箱(25 ℃、5% CO2)中培养，每两天换液一次，待细胞单层生长贴壁率达到90%时，分别用0.1%的胰酶消化1 min后，用含血清的培养基终止消化，轻轻吹打，置于倒置显微镜下观察均为单个细胞后分瓶，按此方法进行至3～4代后，选择长势良好的细胞进行正式试验。

1.2.2 试验设计 取长势良好的对数期FHM和GCO细胞，经0.1%胰蛋白酶消化后，用完全培养基吹打细胞制备单细胞悬液，每种细胞以接种密度1×106cells/孔分别接种于6孔细胞培养板中，置恒温培养箱(25 ℃、5% CO2)中贴壁培养24 h。弃旧培养基，用无血清M199清洗每孔，将每种细胞分为6组，对照组不做任何处理，继续换新的无血清M199培养，其余5组分别加入含不同浓度L-肉碱(0.001、0.01、0.1、0.5、1、5 mmol/L)的无血清M199，每组3个复孔，每孔添加2 mL，置恒温培养箱 (25 ℃、5% CO2) 中继续孵育。FHM细胞孵育6 h，GCO细胞孵育12 h(两种细胞的孵育时间由预试验结果筛选得到)。弃上清液，每孔分别用无血清M199清洗两遍后，参考王秋举等[11-12]的方法进行细胞裂解和总RNA提取。

1.2.3 抗氧化酶活性的测定 采用羟胺法测定细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性，分别采用可见光法、比色法和微量定磷法测定过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽连接酶(γ-GCS)活性，具体操作均按照南京建成生物工程研究所试剂盒使用说明书进行测定。

1.2.4 引物设计及合成 本试验中铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)基因的引物设计参考Craig等[13]所设计的序列，CAT、GPX、谷胱甘肽连接酶合成亚基(GCLC)和β-actin基因所使用的引物由实验室前期试验结果所得，具体设计参考王秋举等[11-12]所设计的序列，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.5 细胞总RNA的提取 根据RNAiso试剂盒说明书提取FHM和GCO细胞中总RNA，以紫外分光光度计检测总RNA浓度和纯度(OD260 nm/OD280 nm=1.8～2.0)，细胞总RNA质量采用12 g/L变性琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.6 用实时荧光定量RT-qPCR法检测4种抗氧化酶基因的相对表达量 用随机引物对总RNA进行反转录，根据反转录试剂盒说明书进行操作，反应体系为20 μL，反转录产物储存在-20 ℃中。采用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒和荧光定量仪进行荧光定量PCR试验。

目的基因和内参基因标准品分别按102、103、104、105、106、107、108、109梯度稀释，每个浓度设2个重复组，每个重复组均取2 μL进行RT-qPCR反应，分析各基因荧光定量PCR反应标准曲线。确定目的基因与内参基因的扩增效率差均小于5%后，以2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。

荧光定量PCR反应体系(20 μL)：ddH2O 6.5 μL，样本模板cDNA 2 μL，q-PCR Mater mix 10 μL，正、反向引物各0.5 μL，染料0.5 μL。PCR反应程序：95 ℃ 下预变性30 s；95 ℃下循环变性10 s，退火50.6 ℃(CuZn-SOD)或56.4 ℃(CAT)或58.3 ℃(GPX)或59.1 ℃(GCLC)或58.3 ℃(β-actin)，72 ℃下延伸30 s，共进行40个循环。

1.3 数据处理

试验数据均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析和Duncan多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 不同浓度 L-肉碱对FHM和GCO细胞SOD活性的影响

从表1、表2可见：FHM细胞中SOD活性呈现升高的趋势，GCO细胞中SOD活性呈现先平稳后升高的趋势；随着L-肉碱浓度的逐渐升高(0.001～5 mmol/L)，L-肉碱组FHM细胞SOD活性除0.001 mmol/L 组外，其余L-肉碱组SOD 活性均显著高于对照组(P<0.05)；GCO细胞SOD 活性仅5 mmol/L L-肉碱组显著高于对照组(P<0.05)，其余L-肉碱组与对照组均无显著性差异(P>0.05)。

2.2 不同浓度L-肉碱对FHM和GCO细胞CAT酶活性的影响

L-肉碱的添加对FHM和GCO细胞CAT活性的调节作用并不完全一致。从表1可见：随着L-肉碱浓度的增加，FHM细胞CAT活性逐渐增强；与对照组相比，除0.001 mmol/L 组外，0.01～5 mmol/L L-肉碱组FHM细胞CAT活性均显著高于对照(P<0.05)。

从表2可见：GCO细胞CAT活性随着L-肉碱浓度的增加呈现先平缓后升高的趋势；仅5 mmol/L L-肉碱组CAT活性显著高于其他组(P<0.05)，其余L-肉碱组与对照组均无显著性差异(P>0.05)。

2.3 不同浓度L-肉碱对FHM和GCO细胞GPX活性的影响

从表1可见：随着L-肉碱浓度的增加，FHM细胞GPX活性呈现先增强后逐渐减弱的趋势;仅0.01 mmol/L L-肉碱组显著高于对照组(P<0.05)，其余L-肉碱组与对照组无显著性差异(P>0.05)。

从表2可见:随着L-肉碱浓度的逐渐增加，GCO细胞GPX活性呈现增强趋势；与对照组相比，仅5 mmol/L L-肉碱组GPX活性显著升高(P<0.05)，其余L-肉碱组无显著性变化(P>0.05)。

2.4 不同浓度 L-肉碱对FHM和GCO细胞γ-GCS活性的影响

从表1可见：随着L-肉碱添加水平的升高，FHM细胞γ-GCS活性呈先升高后降低的变化趋势；仅0.1 mmol/L与0.5 mmol/L L-肉碱添加组显著高于对照组和5 mmol/L组(P<0.05)，其余各组间均无显著性差异(P>0.05)。

从表2可见：GCO细胞γ-GCS活性变化呈波动变化的趋势；仅0.01、0.5、5 mmol/L L-肉碱添加组与对照组有显著性差异(P<0.05)，且5 mmol/L L-肉碱添加组的γ-GCS活性显著高于其他各L-肉碱添加组(P<0.05)。

表1 L-肉碱对FHM细胞抗氧化酶活性的影响Tab.1 Effects of L-carnitine on activities of antioxidase in FHM cells

注：同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同

Note:The means with different letters within the same column are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia

表2 L-肉碱对GCO细胞抗氧化酶活性的影响Tab.2 Effects of L-carnitine on activities of antioxidase in GCO cells

2.5 不同浓度L-肉碱对FHM和GCO细胞CuZn-SOD mRNA相对表达量的影响

从表3、表4可见：与对照组相比，随着L-肉碱浓度的逐渐升高(0.001～5 mmol/L)，两种细胞CuZn-SOD mRNA相对表达量均呈先升高后降低的趋势；所有L-肉碱组FHM细胞CuZn-SOD mRNA相对表达量与对照组均无显著性差异(P>0.05)，仅0.5 mmol/L L-肉碱组CuZn-SOD mRNA相对表达量显著高于1 mmol/L L-肉碱组(P<0.05)；浓度为0.001、0.01、0.1 mmol/L L-肉碱组GCO细胞CuZn-SOD mRNA相对表达量与对照组相比无显著性差异(P>0.05)，而浓度为0.5、1、5 mmol/L的L-肉碱组GCO细胞CuZn-SOD mRNA相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。

2.6 不同浓度L-肉碱对FHM和GCO细胞CAT mRNA相对表达量的影响

添加不同浓度的L-肉碱对FHM和GCO细胞CAT mRNA相对表达量的调节作用并不完全一致。从表3可见：随着L-肉碱浓度的增加，FHM细胞CAT mRNA相对表达量呈先升高后降低的趋势，并逐渐趋于平缓；除0.001 mmol/L与0.1 mmol/L L-肉碱组FHM细胞CAT mRNA相对表达量与对照组无显著性差异(P>0.05)外，其余L-肉碱组均显著高于对照组(P<0.05)。

从表4可见：GCO细胞CAT mRNA相对表达量随着L-肉碱浓度的增加(0.001～5 mmol/L)呈逐渐升高后缓慢降低趋势，所有L-肉碱组均上调了GCO细胞CAT mRNA相对表达水平；与对照组相比，仅0.1 mmol/L L-肉碱组显著升高(P<0.05)，而其余L-肉碱组均与对照组无显著性差异(P>0.05)。

表3 L-肉碱对FHM细胞 mRNA相对表达量的影响Tab.3 Effects of L-carnitine on relative expression levels of mRNA in FHM cells

表4 L-肉碱对GCO细胞 mRNA相对表达量的影响Tab.4 Effects of L-carnitine on relative expression levels of mRNA in GCO cells

2.7 不同浓度 L-肉碱对FHM和GCO细胞GPX mRNA相对表达量的影响

添加不同浓度的L-肉碱对FHM和GCO细胞GPX mRNA相对表达水平的调节作用差异较大。从表3可见：L-肉碱孵育6 h时对FHM细胞GPX mRNA相对表达量均无显著性影响(P>0.05)。

从表4可见：随着L-肉碱浓度的逐渐增加，GCO细胞GPX mRNA相对表达水平呈先升高后降低的趋势，最高值出现在0.5 mmol/L L-肉碱组；与对照组相比，0.5 mmol/L L-肉碱组GCO细胞GPX mRNA相对表达量达到显著水平(P<0.05)，其他L-肉碱组与对照组无显著性差异(P>0.05)。

2.8 不同浓度L-肉碱对FHM和GCO细胞GCLC mRNA相对表达量的影响

从表3、表4可见，随着L-肉碱添加水平的逐渐升高，FHM和GCO细胞GCLC mRNA相对表达量均呈现先升高后降低的变化趋势。从表3可见：与对照组相比，仅0.1 mmol/L L-肉碱组显著上调了FHM细胞的GCLC mRNA相对表达量(P<0.05)，并显著高于其他L-肉碱添加组(P<0.05)。

从表4可见：GCO细胞GCLC mRNA相对表达量的变化趋势与FHM细胞相似，但其最高值与FHM细胞不同，GCO细胞GCLC mRNA相对表达量最高值出现在1 mmol/L L-肉碱组；与对照组相比，L-肉碱添加浓度为0.5～5 mmol/L时，GCO细胞GCLC mRNA相对表达水平均显著上调(P<0.05)，而L-肉碱添加浓度为0.001～0.1 mmol/L时，GCO细胞GCLC mRNA相对表达水平虽逐渐升高，但与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。

3 讨论

3.1 鱼类在精养模式下氧化应激的发生与防御

随着生活水平的不断提高，人们对水产品的需求量不断增加，中国现代水产养殖业正朝向集约化、规模化的方向发展。同时，养殖环境中的各种应激因子也随之增加，不同程度地导致水产动物应激行为的发生，而长期处于不良胁迫下的养殖动物体内原有的氧化还原平衡状态极易受到破坏，导致机体产生氧化应激，进一步影响各组织器官功能的正常运行，造成抵抗力和生产性能的下降，从而影响其经济效益。抗氧化功能对于鱼类的健康疾病起着至关重要的作用，尤其是在现代化精养模式下，鱼类生长速度虽快，但对环境应激的抵抗能力却普遍较弱，易受到氧化损伤而导致疾病的发生[8,14]。机体的抗氧化系统包括抗氧化酶系统和非酶系统两类，抗氧化酶系统是指SOD、CAT、GPX等酶类，SOD催化ROS超氧阴离子转变为H2O2，而CAT和GPX可以将具有强氧化性的H2O2转变为H2O，从而解除超氧阴离子对动物体的氧化损伤作用。非酶系统是指存在于细胞中的天然抗氧化剂，主要包括抗坏血酸、谷胱甘肽、维生素E等[15]，这两个系统相互作用、有机结合，共同发挥清除过多ROS的作用。

3.2 L-肉碱对动物抗氧化系统的影响

对哺乳动物的研究证明，L-肉碱具有明显的抗氧化功能，可以上调动物的T-SOD、CAT、GPX和γ-GCS等抗氧化酶活性[2,11-12,16]，增加动物机体的抗坏血酸、谷胱甘肽、维生素E等非酶抗氧化物质的含量[5,17-18]，维持组织细胞中含硫氨基酸水平[19]。目前，在基因水平上探讨营养素对鱼类抗氧化酶基因表达影响方面的研究较为缺乏。姜维丹[20]研究表明，饲料中适量肌醇的补充能显著上调幼建鲤肠道抗氧化酶CuZn-SOD、Mn-SOD、CAT和GPX活性及其基因表达量，抑制了肠道的氧化损伤，证明了肌醇对幼建鲤肠道抗氧化功能的积极促进作用。Wu等[21]报道，适当水平的锌能提高鲍鱼CuZn-SOD、Mn-SOD和CAT抗氧化酶mRNA表达量。对于L-肉碱抗氧化功能的研究，在哺乳动物上开展的相对较早，但在水生动物方面的研究尚处于起步阶段。王秋举等[22]对L-肉碱抗氧化功能进行了探索，研究结果表明，0.1～1 mmol/L L-肉碱能显著提高鱼细胞抗氧化酶活性，但在对抗氧化相关蛋白基因表达的影响还未见详细报道。为此，本研究中以FHM和GCO两种鱼类细胞为研究对象，在转录水平上探讨了L-肉碱对水生动物抗氧化功能的影响。结果表明，适宜浓度的L-肉碱均显著上调两种鱼细胞抗氧化酶基因表达，这与在哺乳动物上的研究结果具有相似之处，并且L-肉碱的添加浓度与CuZn-SOD和GCLC两个基因的相对表达水平呈现明显的剂量-效应关系。综上所述，本研究中设定的0.1～1 mmol/L L-肉碱水平是提高FHM和GCO细胞抗氧化性的适宜添加量，这一结果与王秋举等[22]的研究结果一致。

3.3 L-肉碱抗氧化功能的机制研究

L-肉碱对哺乳动物和鱼类均展现出明显的抗氧化功能，能在酶活代谢层面和转录水平上分别发挥调节作用，但其机制尚不清楚。目前，学术上对这一问题的揭示逐步倾向Nrf2-ARE(NF-E2-related factor 2/antioxidant response element)信号通路这条途径。Nrf2-ARE信号通路是迄今为止被人们发现的细胞中最为重要的内源性抗氧化应激防御机制，该信号通路的启动意味着细胞抗氧化能力的增强[23]。核相关因子-2(Nrf2)在细胞的抗氧化、脂质和铁等多种代谢途径中起到重要的调节作用，同时Nrf2也是调节抗氧化应激反应的最关键的核转录因子，是Nrf2-ARE信号通路的中枢调节者，在增强细胞抗氧化功能进而预防疾病方面起到尤为重要的作用[24-25]。正常状态下，Nrf2存在细胞质中，处于钝化状态，当细胞受到相应刺激时，Nrf2会移动至细胞核中与抗氧化作用原件(ARE)相结合，上调下游抗氧化酶(如SOD、CAT等)和Ⅱ相解毒酶的基因表达水平，从而提高细胞酶活力达到抵抗氧化应激的作用[26-27]。对哺乳动物的研究表明，Nrf2能保护细胞抵抗氧化应激因子对细胞的氧化作用。Cao等[28]的研究中，建立了L-肉碱对Nrf2核转录因子的联系，结果显示，L-肉碱能显著上调鼠神经节细胞核Nrf2蛋白表达和γ-GCS蛋白的表达量。已有结果表明，在一定条件下，L-肉碱能够激活Nrf2-ARE信号通路，从而上调细胞的抗氧化功能，而L-肉碱的这一功能在鱼类上的作用机制还有待于进一步研究。

综上所述，细胞培养基中添加适宜浓度的L-肉碱作用6 h时，能明显提高FHM细胞CAT和GCLC基因相对表达水平；添加适宜浓度的L-肉碱作用12 h时，能明显上调GCO细胞CuZn-SOD、CAT、GPX和GCLC基因相对表达水平。在体外条件下，推荐L-肉碱的适宜添加浓度为0.1～1 mmol/L。