饲料中不同叶酸、维生素B12水平对黄颡鱼生长及免疫力的影响

，，，，，

(1.天津市晨辉饲料有限公司 天津市水族动物功能性饲料企业重点实验室，天津 301800；2.天津农学院 水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384)

叶酸和维生素B12(VB12)均属于B族维生素，是一类具有辅酶功能的水溶性维生素，在动物营养中起着重要作用[1]。叶酸作为一碳基团的供体或受体，其辅酶以四氢叶酸的形式参与许多生化反应，在氨基酸和核苷酸等物质代谢中起着重要的作用[2]。VB12是甲基钴胺的辅酶，参与体内一碳基团的代谢，与叶酸一起合成甲硫氨酸和胆碱，在生物代谢过程中起到转甲基的作用[3]。方春林等[4]认为，叶酸和VB12是衡量水产动物营养状况的指标，鱼类体内缺乏叶酸和VB12时，均表现为食欲减退，生长性能低下。赵志勇[5]、吴凡等[6]通过研究发现，叶酸、VB12均对鱼体生长有明显的促进作用。

黄颡鱼Pelteobagrusfulvidraco俗称黄姑、黄腊丁、嘎鱼等，隶属于鲇形目Siluriformes、鲿科Bagridae、黄颡鱼属Pelteobagrus，广泛分布于中国各大水系[7]。随着市场需求的扩大，天然水域中的黄颡鱼数量锐减，多数通过人工养殖来满足市场需求[8]。然而，随着养殖规模的扩大和养殖密度的增加，黄颡鱼病害频发，使其品质大幅降低。黄颡鱼病害频发主要与自身摄取营养不足、免疫力低下有关。因此，研究黄颡鱼的营养免疫有助于提高其免疫功能和抗病能力，推动其养殖业的健康发展[9]。叶酸和VB12为黄颡鱼健康生长发育所必需的营养物质，参与生物体内许多重要反应和重要物质的合成，因鱼体自身不能合成叶酸和VB12，只能从饲料中摄取。目前，有关叶酸和VB12对黄颡鱼生长、免疫力影响的研究尚未见报道。本试验中，在饲料中添加不同含量的叶酸和VB12，以探究其对黄颡鱼生长及免疫力的影响，旨在为黄颡鱼养殖技术的提升提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用黄颡鱼购自天津市和来科技有限公司，在天津市晨辉饲料有限公司循环水养殖实验室对鱼体消毒并暂养一周后，挑选体格健壮、规格一致的黄颡鱼900尾，随机分为9个试验组和1个对照组进行试验，每个试验组设3个重复，每个重复为30尾鱼。

1.2 方法

1.2.1 饲养管理 试验在蓝色塑料周转箱(58 cm×68 cm×40 cm)中进行,养殖周期为56 d，每天7:00、19:00饲喂两次，日投喂量为体质量的3%～6%，养殖期间水温为24～30 ℃，pH为7.5～8.0，溶解氧为7.3～8.0。每天记录死亡鱼数及投饵量。

1.2.2 试验饲料的制备 本试验中以叶酸、VB12为影响因素，叶酸水平为0.15%、0.30%、0.45%，VB12水平为0.05%、0.10%、0.15%，采用双因素试验设计中的“3×3因子设计”法，配制成Diet 1、Diet 2、Diet 3、Diet 4、Diet 5、Diet 6、Diet 7、Diet 8、Diet 9共9种饲料，以不添加叶酸和VB12的饲料作为对照组。

表1 试验饲料组成(风干基础)Tab.1 Ingredients of the test diets (air-dry basis) w/%

注：1) 预混料为每千克饲料提供：Cu (CuSO4) 3.50 mg，Fe (FeSO4) 140 mg，Mn (MnSO4) 15 mg，Zn (ZnSO4) 40 mg，I (KI) 0.50 mg，Se (H2NaOSe) 0.30 mg，Co 0.25 mg，Mg 100 mg，Na 100 mg，VA 6000 IU，VD32000 IU，VB19 mg，VB29 mg，VB545 mg，VB67.50 mg，VC 90 mg，VE 60 mg，VK310 mg，烟酸 45 mg，D-泛酸 30 mg，肌醇 80 mg，胆碱 2000 mg

Note：1) The premix provides the following(per kg of diet)：Cu (CuSO4) 3.50 mg，Fe (FeSO4) 140 mg，Mn (MnSO4) 15 mg，Zn (ZnSO4) 40 mg，I (KI) 0.50 mg，Se (H2NaOSe) 0.30 mg，Co 0.25 mg，Mg 100 mg，Na 100 mg，VA 6000 IU，VD32000 IU，VB19 mg，VB29 mg，VB545 mg，VB67.50 mg，VC 90 mg，VE 60 mg，VK310 mg，nicotinic acid 45 mg， D-pantothenic acid 30 mg，inositol 80 mg，and choline 2000 mg

表2试验饲料营养成分(干物质基础)

Tab.2 Nutrient levels of the test diets (air-drybasis)w/%

注：饲料营养水平均为实测值

Note：Nutrient levels are measured and expressed as average values

1.2.3 指标测定与计算

(1) 生长指标。养殖试验结束后，禁食24 h，分别称取每个重复中黄颡鱼的体质量。生长指标计算公式为

增重率(WGR)=100%×(lnWt-lnW0)/W0，

特定生长率(SGR)=100%×(lnWt-lnW0)/t，

饲料系数(FCR)=F/(Wt-W0)。

其中：Wt、W0分别为试验终末和初始鱼体质量(g)；F为饲料摄入量(干质量，g)；t为试验时间(d)。

(2) 免疫指标。从每个重复中随机取5尾鱼，用1 mL注射器从尾静脉取血，后将血液转移至1.5 mL离心管中，于4 ℃下静置6 h，以4000 r/min离心10 min，分离血清于-20 ℃下保存备用。采血后将黄颡鱼在冰浴条件下进行解剖，剥取肝脏。

黄颡鱼血清和肝脏组织中的补体C3、补体C4、一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)活性均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，试验操作严格按照说明书方法进行。

1.3 数据处理

试验数据采用平均值±标准差表示(mean±S.D.)。采用SPSS 18.0软件对试验数据进行单、双因子方差分析(ANOVA)，采用Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 饲料中叶酸、VB12水平对黄颡鱼生长性能的影响

从表3可见：各试验组饲料中叶酸和VB12水平对黄颡鱼终末体质量、增重率及特定生长率均有极显著性影响(P<0.01)，添加叶酸和VB12的试验组黄颡鱼终末体质量、增重率、特定生长率和饲料系数均显著优于对照组(P<0.05)；二者的交互作用对黄颡鱼终末体质量、增重率、特定生长率、饲料系数均无显著性影响(P>0.05)。在其中一因素水平固定的情况下，黄颡鱼终末体质量、增重率、特定生长率均随着另一因素水平的增加而增加，饲料系数有下降趋势；在叶酸水平为0.15%时，VB12水平变化对黄颡鱼生长无显著性影响(P>0.05)；在叶酸水平为0.30%和0.45%时，随VB12水平的升高，黄颡鱼终末体质量、增重率、特定生长率显著升高(P<0.05)。当饲料叶酸/VB12水平为0.45%/0.15%时，黄颡鱼终末体质量、增重率及特定生长率最高且饲料系数最低，除与叶酸/VB12水平为0.15%/0.15%、0.30%/0.15%、0.45%/0.10%无显著性差异(P>0.05)外，均显著高于其他组(P<0.05)。

表3饲料中叶酸和VB12水平对黄颡鱼生长指标的影响

Tab.3EffectsofdietaryfolicacidandvitaminB12levelsonthegrowthperformanceofyellowcatfishPelteobagrusfulvidraco

组别group叶酸/%folic acidVB12/%vitamin B12终末体质量/gfinal body weight增重率/%weight gain rate特定生长率/(%·d-1)specific growth rate饲料系数food conversion ratioDiet 10.150.0555.67±1.44c75.04±4.15c1.00±0.04c3.04±0.03bDiet 20.150.1057.93±1.51bc80.48±4.62bc1.05±0.04bc2.99±0.12bcDiet 30.150.1560.64±0.91abc92.16±3.95abc1.17±0.04abc2.65±0.06dDiet 40.300.0556.53±1.17c77.77±3.69c1.03±0.01bc3.03±0.03bDiet 50.300.1059.40±0.50bc86.21±1.77bc1.11±0.02abc2.79±0.04bcdDiet 60.300.1563.42±1.61ab99.41±4.57ab1.23±0.04ab2.74±0.05cdDiet 70.450.0558.53±1.17bc84.10±4.29bc1.09±0.04bc2.95±0.03bcDiet 80.450.1061.49±1.78abc93.87±6.84abc1.18±0.06abc2.78±0.02bcdDiet 90.450.1566.92±0.89a108.67±2.06a1.31±0.02a2.66±0.08d对照control44.51±1.30d38.95±6.39d0.59±0.05d3.37±0.01a两因素主效应检验 main effect test of the two factors0.1558.081b82.559b1.073b2.894a0.3059.783ab87.799ab1.123ab2.857a0.4562.314a95.544a1.194a2.799a0.0559.910c78.969b1.038b3.011a0.1059.609b86.852b1.114b2.856b0.1563.660a100.081a1.237a2.683c双因子方差分析(P值) Two-way ANVOA(P Value)叶酸 folic acid0.003**0.005**0.006**0.161VB120.000**0.000**0.000**0.000**叶酸×VB120.7360.9350.9660.197

注：同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)；*表示有显著性影响(P<0.05),**表示有极显著性影响(P<0.01)，下同

Note:The means with different letters within the same column are significantly different among the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences;*means significant effect(P<0.05)，** means very significant effect(P<0.01), et sequentia

因素水平效应检测表明：饲料中添加叶酸的最优水平为0.45%，在此水平下，黄颡鱼的终末体质量、增重率、特定生长率均最高，且与0.15%叶酸水平组有显著性差异(P<0.05)，对黄颡鱼饲料系数影响不显著(P>0.05)；饲料中添加VB12的最优水平为0.15%，在此水平下，黄颡鱼的各项生长指标均最好，且显著好于其他VB12水平组(P<0.05)。

2.2 饲料中叶酸和VB12水平对黄颡鱼血清中补体C3、补体C4含量的影响

从表4可见：叶酸、VB12各水平及其交互作用对黄颡鱼血清中补体C3、补体C4含量均无显著性影响(P>0.05);叶酸/VB12水平为0.45%/0.15%时，黄颡鱼血清中补体C3、补体C4含量最高，对照组含量最低，各试验组间无显著性差异(P>0.05)。

表4饲料中叶酸和VB12水平对黄颡鱼血清中补体C3、补体C4含量的影响

Tab.4EffectsofdietaryfolicacidandvitaminB12levelsonserumcomplementC3andcomplementC4contentsofyellowcatfishPelteobagrusfulvidraco

组别 group叶酸/% folic acid VB12/%vitamin B12补体/(mg·dL-1)complement C3补体/(mg·dL-1) complement C4Diet 10.150.055.95±0.213.26±0.20Diet 20.150.106.05±0.383.14±0.14Diet 30.150.157.15±.0153.47±0.29Diet 40.300.056.12±0.613.12±0.12Diet 50.300.106.33±0.313.50±0.46Diet 60.300.156.23±0.442.93±0.29Diet 70.450.056.44±0.113.41±0.26Diet 80.450.107.03±0.123.02±0.71Diet 90.450.157.35±0.403.87±0.15对照 control5.87±0.342.86±0.14两因素主效应检验 main effect test of the two factors0.156.3833.2900.306.2273.1810.456.9383.4320.056.1683.4170.106.5763.2170.156.8043.270双因子方差分析(P值) Two-way ANVOA (P value)叶酸 folic acid0.0520.476VB120.1090.601叶酸×VB120.2270.117

2.3 饲料中叶酸和VB12水平对黄颡鱼肝脏补体C3、补体C4含量的影响

从表5可见：叶酸、VB12各水平及其交互作用对黄颡鱼肝脏补体C3、补体C4含量无显著性影响(P>0.05)；叶酸/VB12水平为0.45%/0.15%时，黄颡鱼肝脏补体C3、补体C4含量最高，对照组含量较低，各试验组间无显著性差异(P>0.05)。

表5饲料中叶酸和VB12水平对黄颡鱼肝脏中补体C3、补体C4含量的影响

Tab.5EffectsofdietaryfolicacidandvitaminB12levelsonlivercomplementC3andcomplementC4contentsofyellowcatfishPelteobagrusfulvidraco

组别 group叶酸/%folic acidVB12/%vitamin B12补体 /(mg·mg-1 prot)complement C3补体/(mg·mg-1 prot)complement C4Diet 10.150.0578.53±4.1027.76±2.64Diet 20.150.1082.25±1.8725.76±1.27Diet 30.150.1584.14±2.2628.37±1.09Diet 40.300.0584.19±1.5326.91±2.13Diet 50.300.1079.49±0.7527.03±1.57Diet 60.300.1580.65±2.5728.16±2.51Diet 70.450.0581.33±0.9024.28±1.28Diet 80.450.1081.41±2.7225.35±2.25Diet 90.450.1586.57±1.5028.89±2.30对照 control 79.97±1.5320.81±0.75两因素主效应检验 main effect test of the two factors0.1583.52827.6770.3082.23427.3700.4580.42325.9740.0584.02926.6940.1081.04726.0500.1581.11028.097双因子方差分析(P值) Two-way ANVOA (P value)叶酸 folic acid0.3200.471VB120.2600.447叶酸×VB120.5420.801

2.4 饲料中叶酸和VB12水平对黄颡鱼血清中免疫指标的影响

从表6可见：饲料中叶酸和VB12水平对黄颡鱼血清中NO含量、NOS活性均有极显著性影响(P<0.01)，二者的交互作用对黄颡鱼血清中NO含量、NOS活性无显著性影响(P>0.05)；在VB12添加水平固定的情况下，0.45%叶酸水平试验组黄颡鱼NO含量及NOS活性均显著高于0.15%组(P<0.05)；在叶酸/VB12水平为0.45%/0.15%时，NO含量、NOS活性均达到最高。因素水平效应检测表明：叶酸各水平间黄颡鱼血清中NO含量有显著性差异(P<0.05)，0.30%、0.45%叶酸水平组NOS活性显著高于0.15%水平组(P<0.05)，最优水平为0.45%；VB12各水平间黄颡鱼血清中NO含量有显著性差异(P<0.05)，0.10%、0.15% VB12水平组NOS活性显著高于0.05%水平组(P<0.05)，最优水平为0.15%。

表6饲料中叶酸和VB12水平对黄颡鱼血清中NO、NOS的影响

Tab.6EffectsofdietaryfolicacidandvitaminB12levelsonserumNOcontentandNOSactivityofyellowcatfishPelteobagrusfulvidraco

组别 group叶酸/%folic acidVB12/% vitamin B12NO/(μmoL·L-1)NOS/(U·mL-1)Diet 10.150.054.01±0.05c8.14±0.05bDiet 20.150.104.12±0.12c8.19±0.22bDiet 30.150.154.30±0.09c8.26±0.15abDiet 40.300.054.41±0.13bc8.22±0.23abDiet 50.300.104.46±0.09bc8.69±0.47abDiet 60.300.154.93±0.20ab9.20±0.23abDiet 70.450.054.95±0.09ab9.22±0.13abDiet 80.450.105.20±0.10a9.47±0.17aDiet 90.450.155.41±0.10a9.48±0.30a对照 control 3.33±0.18d6.78±0.32c两因素主效应检验 main effect test of the two factors0.154.147c5.543b0.304.601b6.051a0.455.189a6.241a0.054.459c5.646b0.104.595b6.006a0.154.883a6.184a双因子方差分析(P值) Two-way ANVOA (P value)叶酸 Folic acid0.000**0.000**VB120.001**0.001**叶酸×VB120.6350.129

2.5 饲料中叶酸和VB12水平对黄颡鱼肝脏免疫指标的影响

从表7可见：饲料中叶酸和VB12水平对黄颡鱼肝脏中NO含量均有极显著性影响(P<0.01)，二者的交互作用对黄颡鱼血清中NO含量、NOS活性均无显著性影响(P>0.05)；在VB12添加水平固定的情况下，0.45%叶酸水平组NO含量及NOS活性均高于0.15%组；在叶酸/VB12水平为0.45%/0.15%时，NO含量、NOS活性均达到最高。因素水平效应检测表明：叶酸0.45%水平组黄颡鱼血清中NO含量和NOS活性含量显著高于0.15%水平组(P<0.05)，最优水平为0.45%；0.15% VB12水平组黄颡鱼血清中NO含量显著高于0.05%水平组(P<0.05)， VB12各水平组NOS活性无显著性差异(P>0.05)，最优水平为0.15%。

表7饲料中叶酸和VB12水平对黄颡鱼肝脏组织NO、NOS的影响

Tab.7EffectsofdietaryfolicacidandvitaminB12levelsonliverNOcontentandNOSactivityofyellowcatfishPelteobagrusfulvidraco

组别 group叶酸/%folic acidVB12/%vitamin B12NO/(μmoL·g-1 prot)NOS/(U·g-1 prot)Diet 10.150.055.07±0.04c6.31±0.14bcDiet 20.150.105.57±0.06bc6.41±0.10abcDiet 30.150.155.98±0.10ab6.46±0.27abcDiet 40.300.055.93±0.10ab6.53±0.31abcDiet 50.300.106.18±0.17ab6.62±0.32abcDiet 60.300.156.04±0.25ab6.78±0.22abDiet 70.450.055.93±0.17ab6.84±0.18abDiet 80.450.106.26±0.09ab7.02±0.05abDiet 90.450.156.53±0.17a7.45±0.29a对照 control4.89±0.16c5.54±0.13c两因素主效应检验 main effect test of the two factors0.155.543b6.394b0.306.051a6.643ab0.456.241a7.107a0.055.646b6.561a0.106.006a6.686a0.156.184a6.898a双因子方差分析(P值) Two-way ANVOA (P value)叶酸 folic acid0.000**0.004**VB120.001**0.215叶酸×VB120.1290.864

3 讨论

3.1 饲料中叶酸和VB12水平对黄颡鱼生长的影响

叶酸和VB12均为机体非常重要的水溶性维生素，二者分别参与机体一碳单位的转移及代谢，对生物合成和细胞分裂生长具有重要的作用[3,5,10]。赵智勇[5]在研究草鱼Ctenopharyngodonidellus鱼种叶酸需要量的试验中发现，在饲料中添加3.6～4.3 mg/kg的叶酸可促进草鱼的生长，还可提高草鱼的饲料利用率。魏建军等[11]探讨叶酸和VB12对中华绒螯蟹Eriocheirsinensis生长、非特异性免疫和免疫力的影响时发现，在饲料中添加叶酸和VB12可显著促进中华绒螯蟹幼蟹的生长，叶酸/VB12的添加水平为2.3/0.2 mg/kg时幼蟹生长最佳。吴凡等[6]研究VB12对草鱼幼鱼生长的影响时发现，当饲料中VB12的添加量为0.10 mg/kg时，草鱼幼鱼的特定增长率和增重率最高。本试验中通过在饲料中添加叶酸和VB12发现，叶酸、VB12对黄颡鱼的生长均具有显著性影响。在叶酸/VB12水平为0.45%/0.15%时，黄颡鱼的增重率和特定增长率最高，饲料系数最低，这与上述学者的研究结果基本一致，表明饲料中添加适宜的叶酸和VB12可提高黄颡鱼的生长性能，提高饲料利用率。

3.2 饲料中叶酸和VB12水平对黄颡鱼组织中补体C3、补体C4含量的影响

目前，鱼类抗应激系统如何形成还未见明确报道，但在淋巴器官和免疫能力成熟之前，先天防御机制是至关重要的，而补体系统是非特异性免疫中非常重要的组成部分，参与机体的防御功能，并且可以增强机体在应急条件下维持稳态的能力[12]。目前，有关维生素对黄颡鱼体内补体C3、补体C4的影响鲜有报道。Sesay等[13]研究表明，饲料中叶酸含量为2.0、5.0 mg/kg时，武昌鱼Megalobramaamblycephala血清中补体C3、补体C4含量得到显著提升。本试验中发现，叶酸和VB12水平对黄颡鱼肝脏及血清中补体C3、补体C4含量无显著性影响，但当叶酸/VB12添加量为0.45%/0.15%时，黄颡鱼肝脏及血清中补体C3、补体C4含量最高，这与上述学者的研究结果基本一致，说明叶酸和VB12的添加对提升黄颡鱼组织及血清中补体C3、补体C4含量有一定的促进作用。

3.3 饲料中叶酸和VB12水平对黄颡鱼组织中NO含量、NOS活性的影响

一氧化氮NO是第一个被发现的参与体内信号转导的气体信号分子[14]，在神经、免疫、呼吸等系统中均发挥着重要作用[15]。NO的生物合成主要受NOS调节，此外，其还受底物浓度和辅助因子的调节[16-17]。目前，尚未见有关叶酸和VB12对鱼类组织中NO及NOS影响的报道。姜雅秋[18]研究表明，叶酸和VB12可显著降低Hhcy造成的血管内皮的损伤，使血浆中NO含量上升，NOS活性提高；贾文斌等[19]的试验表明，给予适当的氨基酸和维生素制剂干预，可明显减轻力竭疲劳大鼠Rattusnorvegicus骨骼肌的损伤，使保护性物质NO、NOS增高。本试验结果表明，饲料中添加叶酸和VB12对黄颡鱼肝脏组织和血清中的NO含量、NOS活性有显著性影响，在添加的叶酸/VB12水平为0.45%/0.15%时，肝脏组织和血清中NO含量、NOS活性均达到最高。这与姜雅秋[18]、贾文斌等[19]的研究结果一致，但刘欢[20]研究发现，叶酸能提高脑缺血大鼠抗氧化能力，使NO含量降低，这种结果的差异可能与试验对象不同有关。

4 结语

黄颡鱼摄食缺乏叶酸和VB12的饲料会表现出生长缓慢、饲料转化率低等症状，在饲料中添加叶酸和VB12可改善黄颡鱼的生长性能，提高免疫力。本试验结果表明，叶酸水平为0.45%、VB12水平为0.10%时，可显著促进黄颡鱼的生长，提高黄颡鱼的免疫力，明显降低饲料成本。