植物激素萘乙酸对诱导石斛芽的影响

丁锦平，魏理，张延森

(商丘师范学院 生物与食品学院，植物与微生物互作重点实验室，河南 商丘 476000)

铁皮石斛(Dendrobiumoffcinalekimura et Migo)是我国珍贵的中药材，它在我国的大部分地区都有分布[1].铁皮石斛的药用主要成分为石斛多糖和石斛碱，其有着滋阴、润肺、生津止渴、益胃、增建免疫活性的作用，是南亚和东南亚地区非常有名的中草药.铁皮石斛的产品如石斛风斗石斛花等的市场价格不菲.铁皮石斛在野生条件下繁殖速率低下、生长缓慢，再加上掠夺性的采挖使得非常稀缺的铁皮石斛的自然野生资源日益减少，远远不能满足国内和国外市场经济发展和临床医学的需要，因此对石斛进行组织培养也是对自然资源的一种保护，是一项很有意义的项目和课题，对石斛进行组培试验是一个比较有效的快捷的保护方法[2].本试验在基本培养基MS的基础上通过植物生长调节剂NAA对铁皮石斛部分芽诱导阶段的作用效果，比较不同浓度梯度的NAA对石斛组培的影响，来探索NAA对石斛组培苗的最适合的NAA浓度梯度，希望简化培养基成分，为石斛资源再生利用提供参考.

1 试验材料与方法

1.1 供试材料的选择与处理

1.1.1 初代培养供试材料的选择与处理

选择生长良好无病害的石斛茎条，选取每条茎的中间部分即去掉每个茎条的前两节和后两节，这样可以缩小每个外植体的生长差距.是因为铁皮石斛同一枝条上不同位置的茎段培养出的再生植株生长状况不同，以茎尖最好，茎中次之，茎基较差[4].

1.1.2 继代培养供试材料的选择与处理

选择生长良好的石斛组培苗，并将其根部去除，以减少根部产生的激素等因素对试验结果产生的影响.

1.2 试验变量设置

培养基如下表，在基本培养基不变的情况下，设置不同NAA变量.

表1 初代培养不同组合

表2 继代培养不同组合

1.3 培养条件

温度为(23±1)℃，光源为日光灯，光照条件12 h/d.每个培养瓶中倒入大约20 ml的培养基.

1.4 外植体的消毒

1.4.1 初代培养的消毒

将带叶芽茎段剥去叶片，用流水冲洗干净.在无菌条件下用75%的酒精与0.1%的氯化汞对外植体进行消毒处理,将茎段放入0.1%的HgCl2溶液中，浸泡10 min.接种时再将切好的外植体放入75%的乙醇溶液中，浸泡30 s.

1.4.2 继代培养的消毒

继代外植体不需要过复杂的消毒，在接种时用无菌水冲洗掉杂质即可.

1.5 外植体的接种

1.5.1 初代培养的接种

将石斛茎切成1 cm左右的小段，并且每段包含一个节点，这样每个外植体就会至少包括一个芽点，有利于不定芽的发生.每瓶接种3个外植体，在瓶体上标号以便追踪观察每个外植体的生长情况和记录数据，每个浓度梯度设置5次重复.接种时将石斛茎段平放在培养基上，使培养基没过外植体的一半，这样可以使外植体更好地吸收培养基里的营养.在茎段接种培养过程中，枝条的来源、茎段在培养基上的放置方式等对外植体的生长均有影响，石斛茎段在培养基上水平放置可以获得完整的再生植株，极向垂直接入培养的茎段无丛芽发生，不久即褐化枯死，倒向插入的茎段褐化较少[5-6].

1.5.2 继代培养的接种

将外植体形态学上端向上接种在培养基上，一个培养瓶中根据外植体大小接种一个芽苗，每个浓度梯度设置5次重复.

2 试验结果与分析

2.1 初代培养试验结果

经过一个月的培养，5个组合均接种15个外植体，发芽率均为100%，每个试验组的外植体不定芽生长一致，初代培养各培养基组间生长差异不显著.

图1 枯萎状况的外植体Figure1 faded condition set of explants

2.2 继代培养丛生芽的萌发

培养13 d后开始出现新的不定芽，经过30 d的培养之后统计不定芽生长数量，A组各个重复生长初的丛生芽数量依次为3、3、3、0、3；B组各个重复生长初的丛生芽数量依次为6、3、3、1、3；C组各个重复生长初的丛生芽数量依次为6、3、6、9、3；D组各个重复生长初的丛生芽数量依次为3、3、0、3、6；E组各个重复生长初的丛生芽数量依次为1、1、2、2、1.其中有A、B组外植体枯萎的情况(如图1).C、D、E组无枯萎现象，其中C组不定芽生长最多.

2.3 继代培养外植体的生长

试验继代转接苗初始长度平均3 cm，经过30 d培养外植体生长长度的变化的量A组平均生长量为0.32 cm，B组平均生长量为0.34 cm，C组平均生长量为0.84 cm，D组平均生长量为0.56 cm，E组平均生长量值为0.46 cm.外植体生长状况：C组发芽数量最多且生长量最大，所以NAA适合浓度为0.5 mg/L.

3 讨 论

石斛喜欢高湿环境，内生细菌比较丰富，初代培养时外植体的消毒会影响后期芽的诱导.在选取外植体材料时选取植株的茎尖部位，或者将石斛的果实作为外植体材料，可以减少外植体携带真菌和细菌的数量.

从国内外的研究进展来看，铁皮石斛组培快繁技术取得了比较明显的进步，在野生资源保护和满足市场需求方面起到了积极作用，但在激素和其他培养方法的选择和优化方面还需要进一步的研究[7-9].近些年的组培快繁技术研究主要集中在提高组培苗的繁殖系数方面，对于不同方式方法培养出的种苗药用有效成分差异以及不同培养条件下的种苗药用有效成分累积规律还不清楚，还有待进一步研究