沙门氏菌的特征及检测方法研究进展

杨凌君， 叶 玲， 赵奕敏， 梁秀婷， 骆文俊， 王琤韦华*

（江西科技师范大学生命科学学院，江西南昌 330013）

沙门氏菌（Salmonella）是一种常见的人畜共患病原菌，对人和动物的危害极大 （吴荔琴等，2017）。感染沙门氏菌后会加剧发病率或死亡率，降低动物的繁殖生产力。沙门氏菌容易污染食物，对食品安全构成威胁 （Vivek等，2015；何晓芳，2013），因此有必要创建一种快速准确的沙门氏菌检测方法。本文综述了沙门氏菌的特征以及迅速检测沙门氏菌的方法，以期为沙门氏菌的迅速检测提供理论依据。

1 沙门氏菌概述

沙门氏菌属作为肠杆菌科的一个大属，是一种重要的革兰氏阴性食源性致病菌，在自然界分布广泛，种类繁多（朱奇等，2015）。食用被沙门氏菌污染的水和食物后，在宿主体内可以引起肠道系统疾病（Wan 等，2017；Gong 等，2017）。 沙门氏菌属根据细菌抗原分为四十二个群和两千多种血清型，主要致病菌是A～E群的某些菌株（黄敏，2017）。通常情况下沙门氏菌使用量超过105cfu即可造成人类感染，而对于高度易感染人群15～20 cfu即可引起沙门氏菌感染 （Kokkinos等，2014）。蛋和肉类是沙门氏菌的主要载体。通过对沙门氏菌多方面的研究，可以提高禽蛋和肉类产品的食用安全指数。

2 沙门氏菌的特征

2.1 理化特征 沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般沙门氏菌具有菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原和表面抗原 （荚膜或包膜抗原）三种抗原。窦雪如（2016）通过对沙门氏菌的质量控制考核得出，沙门氏菌的三种抗原中，H抗原是蛋白质，不耐热，存在于鞭毛中，由鞭毛素组成，而鞭毛素中氨基酸不同的排列组合，决定着H抗原的特异性。胡丽君（2017）通过对147株肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和海德尔堡沙门氏菌进行全基因组测序，对比分析三种菌株携带的耐药基因发现，不同血清型及不同来源的耐药菌株携带的耐药基因不同。申永秀等（2018）对来源于人和动物的261株沙门氏菌进行血清分型，对15种抗生素进行药敏试验发现，多重耐药性菌株较多，且人源与动物源菌株间耐药特征存在明显的相关性。

2.2 致病性 沙门氏菌属有的对人类致病，有的只对动物致病，也有的对人和动物都致病。关红等（2014）发现，从内蒙古地区奶牛乳房炎和子宫内膜炎病料中分离到的沙门氏菌能够引起小鼠发病，且致病力较强。蔡双双等（2014）将分离鉴定得到的鸭源鼠伤寒沙门氏菌分为HP-2和HP-3株，用HP-2感染的小鼠全部死亡，有60%经皮下注射途径所感染的13日龄雏鸭死亡。隋明等（2018）通过从都江堰地区的53份冷鲜肉食品样品中检测出30株沙门氏菌分离株，其中24株沙门氏菌为致病性菌株，证实该地区冷鲜肉食品中沙门氏菌污染很严重，均具有很强的致病性。

2.3 耐药性 由于抗生素的大量使用，近年来全世界面临耐药菌株加速出现等严重问题 （葛林，2018）。如沙门氏菌不仅耐药率呈现出逐年上涨的趋势，而且还产生了严重的多重耐药性，很多经常使用的抗生素药效明显降低乃至无效（刑艳萍等，2010）。廖成水等（2011）用鸡肉中的98株沙门氏菌对22种药物敏感性进行检测发现，高达96.94%的沙门氏菌的抗药力为三倍或者更高，而56.12%菌株的耐药性高于七倍，最耐药的菌株至多可以耐受18种抗生素。武运等（2017）研究发现，17株肠炎沙门氏菌与11株哈瓦那沙门氏菌对经常使用的抗生素药物的耐药性比较严重。林亚军等（2018）选取琼脂稀释法对39株分散宠物源沙门氏菌进行敏感性试验发现，39株宠物源沙门氏菌对至少六种抗菌药都有抗药性，高达97.4%的菌株对环丙沙星和阿莫西林具有抗药性。钟舒红等（2018）利用K-B纸片法分散和测定沙门氏菌及他的血清型，并且使用24种抗菌药物对随机选取的80株分离株开始了敏感性试验发现，100%沙门氏菌分离株具有多重耐药性，而有78.75%的分离株具有高达10～16重耐药。随着沙门氏菌耐药性增强，合理使用抗生素以及研发新的抗菌剂成为治疗沙门氏菌相关疾病的关键。

2.4 受有机酸的抑制作用 有机酸以未分离分子的方式存在时，其可以穿透细胞壁，搅乱“pH敏感细菌”的一般生理，作用结果和抗生素十分相似（Thompson 等，1997）。 赵建芳等（2017）研究酢浆草的乙醇溶液和水溶液的提取物对4种细菌和1种真菌的抑制效果发现，酢浆草乙醇提取物对沙门氏菌和大肠杆菌有着很强的抑制效果。赵景鹏等（2018）通过对肉仔鸡饲喂不同有机酸与精油组合发现，丁酸与其他精油组分对肠炎沙门氏菌具有协同抑制功效。基于沙门氏菌受到有机酸抑制作用这一现象，喂养禽类添加能较强抑制沙门氏菌的有机酸与其他物质的混合物，可以从源头上降低沙门氏菌对禽类以及禽蛋的感染，减少因食用被沙门氏菌感染的肉类以及蛋类而引起的食物中毒现象。

2.5 低温控制生长 环境因素是影响沙门氏菌消长的重要因子之一，其中，温度变化是影响沙门氏菌生长的主要因素 （Huang，2003）。赵格等（2016）发现，蛋壳完整的鸡蛋受到致病菌的污染，可以在室温下或冷藏环境中以清洁的方式贮存1个月，然而，在较高的温度下，病原体会在第20天侵入卵。沈学怀等（2016）经过在鸡蛋壳表面人为的接种三种有差别的沙门氏菌，在不同的环境中储藏，发现较低温度和较低湿度条件能够减少蛋壳表面沙门氏菌的生存时间。温杰锋等（2017）发现，在夏秋冬三季，卵壳和卵白的沙门氏菌感染率呈下降的趋势，而且夏季感染率远高于秋冬。

3 沙门氏菌快速检测方法

3.1 免疫学方法

3.1.1 荧光免疫技术（IFT） 荧光法是利用Uio-66-NH2的荧光猝灭特征和核酸适配体的吸附性，创建了荧光生物传感器用于沙门氏菌的检测，当改性的沙门氏菌和合适的适配体被原料吸附到表面时，沙门氏菌及其适配体会被特别束缚并从材料表面上移除，材料与荧光素之间的电子转移过程被割断，荧光素的荧光恢复（蒋晓华等，2018）。Wen等（2013）利用免疫磁球微球和免疫荧光微球结合沙门氏菌，可直接在荧光显微镜下检测夹心免疫复合物，并用荧光光谱仪进行定量，该方法适用于105～107cfu/mL线性范围内，最低检测限值为10 cfu/mL。Wang等（2014）用高荧光强度和高水溶性的CdTe量子点当成荧光标识物，创建了检测蛋壳上的沙门氏菌免疫光的高度特异性方法，发现细菌液体浓度与荧光强度呈现出良好线性关系的沙门氏菌浓度为3×102～3×107cfu/mL。Pandey等（2014）应用了一个新的基于Vi荚膜多糖检测的夹心荧光免疫分析法，使用阳离子受体分子多粘菌素B作为黏结剂而抗Vi抗体作为捕集剂，以碱性磷酸盐标记二抗，对硝基苯酚磷酸盐为显示底物，特异性检测伤寒沙门氏菌，检测限为10 cfu/mL。荧光免疫技术在检测过程当中比传统方法更快、更简单、更灵敏。然而荧光免疫技术的结果鉴定存在主观性和非特异性染色的问题，并且操作环节也比较复杂。

3.1.2 酶联免疫吸附测定方法（ELISA） 酶联免疫吸附测定方法是利用在抗原和抗体之间产生的固相化和酶标记。Kumar等（2008）选用酶联免疫吸附测定方法检测伤寒沙门氏菌。Bang等（2012）创立间接竞争酶联免疫吸附测定方法用于检测鼠伤寒沙门氏菌。张帅等（2016）创建双抗夹心酶联免疫系统的基础是吸附多抗体当作96孔酶标记的抗体，并利用辣根过氧化物酶标记单抗体，检查到模仿被污染的肉类中沙门氏菌的上限是800 cfu/g，与其余的血清类沙门氏菌没有交叉反应，特异性较好。李珊珊等（2018）创建C2和C3亚群沙门氏菌的酶联免疫吸附测定方法，结果表明对沙门氏菌C2亚群的两种菌株以及C3亚群的一种菌株的最低检出值都能够到达105cfu/mL，且用于鉴定特异性的其他沙门氏菌和非沙门氏菌在浓度为108cfu/mL时无交叉反应。ELISA方法具有使用方便、检测迅速、特异性强、灵敏度高等优点。然而该方法检出抗体的持续时间较长，更符合抗体消长规律。

3.2 分子生物学方法

3.2.1 聚合酶链式反应方法（PCR） PCR方法是Kary Mullis在1985年建立的一种能够在体外进行基因扩增的方法 ，该方法能够快速在体外进行扩增目标基因的DNA片段，达到检测所需的检测量（张萍，2015）。 Jacobsen 等（2007）研究表明，荧光定量PCR不能有效区分死菌和活菌，所以荧光定量PCR方法不适用于检测加热致死的菌体样品。Bakthavathsalam等（2013）利用IMS实时PCR检测牛奶与柠檬汁中的沙门氏菌，3～4 h内可检测103cfu/mL的沙门氏菌。Zheng等（2014）创建的PCR-IMS技术是用荧光定量PCR和免疫磁珠分离共同结合而成，分别经过7 h和14 h的增菌后可检测鸭翅中101～100cfu/25g正常的沙门氏菌和热受损的沙门氏菌。王青龙等 （2018）根据GenBank公布的亚利桑那沙门氏菌和其他沙门氏菌gud D基因序列，研究了Taqman探针和引物对沙门氏菌进行实时荧光PCR特异性试验，发现试验检测结果与传统相同，拥有检测周期短、操作简单等优点，其中灵敏度试验可以达到1～10 cfu/mL。荧光定量PCR方法不适合检测热诱导细菌样品，可是结合荧光定量PCR和免疫磁珠分离技术可以检测出热损伤的沙门氏菌。

3.2.2 环介导等温扩增技术 （LAMP） LAMP技术是一种新式的核酸扩增技术，其在60～65℃的恒温前提下将目标序列扩大到109水平（王羽，2010；Nomomi等，2000）。 LAMP 技术与 PCR 扩增技术相比，它的灵敏度、检测限度和特异性均能满足检测目标，而且LAMP技术优于PCR技术（Tomita 等，2008）。 Ravan 等（2012）利用 prt基因当作沙门氏菌D血清群的靶基因，对5个沙门氏菌D群和4个其余的沙门氏菌血清群进行了特异性检出。Chayapa等（2012）创立了肠炎沙门氏菌的RT-LAMP检测技术，通过浓缩培育16 h后，纯细菌的检测范围包括使用DNA酶处理及没有使用DNA酶处理的分别为100cfu/mL和101cfu/mL。Zhuang等（2014）利用bcf D基因建立的LAMP检测限为5×100，反应时间为25 min。王瑾等（2016）根据沙门氏菌的inv A基因序列研制了一种利用米氏绿荧光染料检测沙门氏菌的新的LAMP技术，发现检测总过程只需45 min，灵敏度达到6 cfu/管，而且经过模仿人为污染的25 g沙门氏菌的鸡肉样品，在37℃完成了用来检测样品中的实时荧光定量环介导等温扩增的DNA模板，发现灵敏度到达450 cfu/g，一共大约耗时7 h。LAMP技术拥有特异性高、敏感性高、简单、方便和成本低的特征，但在检测过程中容易污染，造成假阳性。

3.2.3 探针方法 检测沙门氏菌探针方法的原理是将纳米粒子与数百个量子点连接起来，制备用于信号放大的显示探针，并且使用亲和性和生物素的特异性结合原理，制备能捕捉到沙门氏菌DNA荧光强度的探针。Cremonesi等（2014）利用Taq Man荧光探针建立实时PCR对沙门氏菌进行检测，灵敏度达1 pg基因组DNA，相当于1 cfu/mL。谢同彬等（2017）通过制备CdTe量子点-纳米金显示探针与磁性纳米粒子捕获探针结合成的复合纳米探针对样品进行检测发现，沙门氏菌为10～1000 fmol/L时，其DNA浓度与荧光强度展现出较好的线性关系，检出上限为8 fmol/L，最低限值为4 fmol/L。探针方法具有敏感、特异、简便、快速的特点。

3.2.4 LAMP微流控芯片技术 LAMP微流控芯片技术是用于沙门氏菌等食源性病原体的一种将LAMP技术与微流控芯片技术相结合的技术。微流控技术经过化学分析设备的小型化和集成，最大限度地将分析实验室的作用集成到芯片中（Jokerst等，2012）。LAMP微流控芯片技术集成了LAMP反应系统在芯片上。鞠鹤鹏等（2018）通过设计LAMP引物与微流控芯片制作成用来检测三种致病菌的LAMP微流控芯片，其中这三种致病菌分别为沙门氏菌、大肠杆菌O157和金黄色葡萄球菌，发现制作好的LAMP微流控芯片拥有良好的特异性，三种致病菌的检测灵敏度都可以到达100 cfu/mL，可以用在食源性致病菌的迅速现场检测方面。LAMP微流控芯片技术具有体积小、分析速度快、样品和试剂用量少等优点，然而试验结果中易出现假阳性，降低了试验结果的准确性。

4 结语

目前，已经有很多快速检测沙门氏菌的技术，但在实践中，大多数技术都存在着操作环节复杂、耗时多、灵敏度低等部分缺点。而探针方法却具有敏感、特异、简便、快速的特点。由于沙门氏菌引起的食源性疾病较为严重，其检验技术始终受到人们的重视，因此有必要研究出一种更简便、灵敏度更高、耗时更短、花费更少的检测方法，预防沙门氏菌的污染。