干酪中抗氧化肽的研究进展

宋雪梅，梁琪，张炎，吴晗

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，兰州 730070；2.甘肃省功能乳品工程实验室，兰州 730070）

0 引 言

食品中活性氧自由基将削弱食品的感官性状，导致食品品质下降、货架期缩短。虽然通过加入人工合成的抗氧化剂能够改善食品的感官性状，但是对人体存在潜在危害。在这情况下，食源性抗氧化剂由于具有低毒等特点，受到关注。抗氧化肽是一种小分子量短肽，含有丰富的必需氨基酸，活性较高，易于被机体吸收，具有阻止自由基形成、清除自由基和活性氧等作用。大量研究表明：提高抗氧化肽摄入量可以降低疾病发生率[1-2]。

干酪是全球贸易量最大的乳制品之一，营养价值高，富含蛋白质、短链脂肪酸、矿物质和维生素等，因此，也是许多生物活性物质的重要来源。干酪中发现的生物活性物质有功能性多肽、脂肪酸、有机酸、共轭亚油酸等。其中，具有抗氧化活性的多肽已在Cheddar[3]、Parmigiano-R eggiano[4]、农家干酪[5]中发现。干酪抗氧化肽不但能阻止其贮藏过程中氧化反应的发生，增加干酪营养价值[6]，且在减少机体心血管疾病发生，抑制腹部脂肪积累，阻止代谢综合证产生等方面也具有作用[7]。因此，本文主要就干酪抗氧化肽的形成机理、提取方法、形成的影响因素及特征等进行综合阐述，以期为提高干酪抗氧化性，开发功能性干酪提供参考。

1 干酪抗氧化肽的形成机理

大多数生物活性肽在原蛋白或没有被激活时无活性，只有通过胃肠系统被胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶酶解后或者被乳酸菌的蛋白酶和肽酶所降解后，才能显示生物活性。αs-酪蛋白，β-酪蛋白、κ-酪蛋白经胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶降解后，所有蛋白降解产物的抗氧化性呈增加趋势，且κ-酪蛋白降解的肽的抗氧化性增加了3倍[6]。Stracchino软质干酪经胃肠系统消化发现，源自β-酪蛋白的六肽EAMAPK和AVPYPQ含量高，且抗氧化活性强[8]。不同菌种Mozzarella干酪的蒸馏水、p H 4.6醋酸缓冲液和12%三氯乙酸可溶性肽在模拟胃肠液环境下均具有一定抗氧化活性[9]。

除此之外，干酪本身在生产过程中也产生抗氧化肽。酶凝干酪，需经历2周（如Mozzarella干酪）甚至2年（如Parmigiano-Reggiano干酪和Cheddar干酪）以上成熟。干酪成熟对干酪特有风味和品质的形成具有重要影响。在此过程中，酪蛋白在纤溶酶、残余凝乳酶等作用下降解为中等分子量的寡肽，再在乳酸菌所含有的蛋白酶和肽酶作用下不断生成小分子多肽。多肽不断被降解，而另一些多肽又不断形成和积累[10-11]。源自乳酸菌参与蛋白质降解的物质有3类，分别是降解酪蛋白的细胞壁蛋白酶、运送多肽到细胞内的转运蛋白和降解寡肽为小分子多肽和游离氨基酸的细胞内肽酶[12]。已发现5种细胞壁蛋白酶，对疏水性酪蛋白具有强烈的倾向性。伴随着干酪成熟过程中的蛋白质降解，特异性生物活性多肽如抑菌肽、降血压肽、抗氧化肽等被释放。一些生物活性肽能够抵制肽酶消化，被机体吸收后，进入血管，对机体产生有益作用[13]。相关研究表明已在Cheddar[3]、Coalho[14]、Quesofresco[15]、Parmigiano-Reggiano[4]等干酪中发现了具有抗氧化作用的生物活性肽。

综上所述，除了干酪经人体消化后产生抗氧化肽外，干酪中抗氧化肽主要源自其成熟过程中的蛋白质降解产物，影响蛋白质降解的因素如发酵剂、凝乳酶、干酪的理化性质如pH、盐含量、成熟温度等均影响到干酪中抗氧化肽的形成与积累。

2 干酪抗氧化肽的提取

多肽浓度越高,对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（简称DPPH）自由基的清除能力越强[16]。干酪抗氧化性与其抗氧化肽有关。目前，干酪抗氧化肽的提取主要采用以下方法：直接蒸馏水提取，或蒸馏水提取后再将pH调整到4.6的提取法；pH 4.6醋酸缓冲液提取法；12%三氯乙酸提取法；乙醇提取法；磷酸缓冲溶液提取后再用盐酸将p H调到4.6的提取法。

研究发现，Blue、Danablue、Pont-l'Eveque、Munster、Camembert和Brie等干酪水溶性肽和70%乙醇可溶性肽均具有显著抗氧化活性[17]。巴西Coalho干酪水溶多肽提取物具有抗氧化活性[14]。马玲等研究了不同菌种Mozzarella干酪蒸馏水、p H 4.6醋酸缓冲液和12%三氯乙酸提取物的抗氧化活性，发现12%三氯乙酸提取物中多肽含量最高，其抗氧化活性最强[18]。

MEISTER MEIRA等通过对Roquefort干酪p H 7.0磷酸盐提取，1 mol/L盐酸沉淀后的上清液质谱鉴定，发现源自β-酪蛋白的HKEMPFPKYPVQPF具有抗氧化活性，YQEPVLGP对3-乙基苯并噻唑-6-磺酸（简称ABTS）自由基具有清除作用[19]。MUSHTAQ等采用类似方法提取的不同温度储藏的Himalayan干酪中含有水溶性多肽的提取物对DPPH、ABTS自由基均具有清除作用[20]。目前，在干酪抗氧化作用研究中，较多采用了以蒸馏水或者磷酸缓冲溶液作为提取溶剂，再将p H调整到4.6的提取方法获得提取物，水溶性提取物中含有具有抗氧化作用的多肽，即抗氧化肽粗品。

3 影响干酪抗氧化肽形成的因素

3.1 发酵剂

生产发酵乳制品所用的发酵剂有嗜热链球菌、乳酸乳球菌、保加利亚乳杆菌等。在干酪生产中，发酵剂除了参与凝乳外，还参与干酪成熟。发酵剂含有的细胞壁蛋白酶、肽转运蛋白、胞内肽酶等参与蛋白质降解，使之产生一些具有抗氧化作用的多肽。发酵剂是影响干酪抗氧化肽产生的主要因素之一。

不同种属微生物对抗氧化肽形成产生具有较大影响，抗氧化肽的形成具有菌株特异性[21]，L.delbrueckii subsp.Bulgaricus发酵的酸奶中发现了源自κ-酪蛋白（f96-106）的抗氧化肽Ala-Arg-His-Pro-His-Pro-His-Leu-Ser-Phe-Met[22]，L.helveticus和Sac.Cerevisiae发酵的乳饮料中发现了抗氧化肽SKVLPVPQ[23]，不同菌种Mozzarella干酪成熟过程中水溶性肽提取物的抗氧化活性存在差异[9]。分别添加了Lactobacillus casei ssp.casei 30和Lactobacillus paracasei ssp.paracasei 22的Cheddar干酪中的抗氧化肽活性较强[24]。

干酪中添加益生菌能够进一步增加抗氧化肽。分别添加了干酪乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌等益生菌的Himalayan干酪（Kalari）的水溶性多肽提取物都显示具有较强的抗氧化活性[20]。益生菌发酵乳杆菌ME-3 Pikantne干酪的水溶性多肽提取物具有较强抗氧化活性[25]。益生菌鼠李糖乳杆菌Cheddar干酪在成熟末，其水溶性多肽提取物对DPPH自由基清除力和还原力分别增加了7.46%和17.58%[26]。加入干酪乳杆菌后，农家干酪中水溶性多肽的抗氧化活性显著提高[27]。加入了植物乳杆菌和干酪乳杆菌Cheddar干酪的水溶性多肽提取物抗氧化活性也显著提高[28]。所以，在干酪生产过程中，通过合理优化发酵剂或添加不同特性的益生菌，能够生产出抗氧化肽含量高和活性强的干酪。

3.2 凝乳酶

酪蛋白的胃蛋白酶产物中发现了具有清除自由基的活性多肽[29]。比较酪蛋白被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶降解后多肽对羟基自由基的清除能力，发现木瓜蛋白酶降解酪蛋白的多肽具有最强抗氧化活性[30]。在添加了凝乳酶、无发酵剂的新鲜山羊乳干酪中也发现了抗氧化肽[31]。动物性凝乳酶（95%凝乳酶和5%牛胃蛋白酶）、植物性凝乳酶（Cynara cardunculus）和微生物性凝乳酶（Mucor miehei）制作的Burgos干酪进行DPPH自由基清除和金属离子螯合试验时发现，不同凝乳酶干酪水溶性多肽提取物均具有抗氧化作用，但动物性凝乳酶干酪中抗氧化肽的含量较低[32]。酪蛋白经过不同蛋白酶降解后，能够单独产生抗氧化肽。同时，由于不同凝乳酶对酪蛋白酶切位点不同，不同凝乳酶对干酪抗氧化肽积累有较大影响。

3.3 乳源种类

比较不同品种牛乳制作的Caciocavallo干酪的抗氧化活性，发现两种干酪的水溶性多肽均具有抗氧化性，且意大利黑白花牛乳制作的Caciocavallo干酪的水溶性多肽的抗氧化作用强于意大利棕色牛乳制作的干酪[33]。水牛乳和普通牛乳Cheddar干酪中提取的多肽均具有抗氧化性，且水牛乳Cheddar干酪中多肽的抗氧化性较强,两者对结肠癌细胞产生的自由基均具有抑制作用[34]。骆驼乳发酵产物比荷斯坦牛乳发酵产物具有更强的抗氧化活性[35]。虽然源自不同畜种的乳蛋白具有高度同源性，但是山羊乳、绵羊乳和牛乳间的物化特性不同,导致干酪抗氧化肽的活性出现差异。另外，不同畜种间的乳蛋白基因变化也显示将会释放不同结构和功能的生物活性肽[36]。

3.4 成熟条件

干酪生物活性肽的生成，是酶和微生物在适宜温度下持续作用的结果，因此，成熟条件作为干酪生产中重要的操作单元，对干酪生物活动肽的形成也具有重要影响。4℃、25℃储藏的H imalayan干酪的水溶性多肽的抗氧化性增强，而冷冻储藏的干酪抗氧性不受影响[37]。对不同成熟阶段Cheddar干酪抗氧化性研究发现，成熟4个月之前，干酪抗氧化作用增强，5个月后，干酪抗氧化降低，且在7-9个月的成熟期间，保持不变[24]。但是Songisepp等发现益生菌干酪中抗氧化活性随成熟时间的延长呈现增加趋势[25]。

3.5 其它影响因素

干酪是生物学和生物化学动态变化的产品。生产过程中采用的技术如高压等能影响乳成分，促进生物活性物质的形成和释放。Quesofresco干酪经真空包装后，采用高压处理，发现高压对干酪水溶性提取物的抗氧化作用有影响，且在压力400 M Pa，中心温度40℃，处理20 min时，干酪抗氧化作用最强[15]。Cynara cardunculus蛋白酶制作的未杀菌和杀菌山羊乳和绵羊乳干酪中均发现了抗氧化肽[38]。因此，通过改变生产中的一些工艺条件，能够增加干酪的抗氧化活性。

4 干酪抗氧化肽特征

乳源性活性肽主要源自αs1-酪蛋白，其次为β-酪蛋白和αS2-酪蛋白，少部分来自κ-酪蛋白[39]。乳酸菌发酵的酸奶中发现了抗氧化肽[40]。抗氧化肽一般由5～16个氨基酸残基组成[41]。肽的抗氧化性主要与其组成、结构和疏水性有关[42],Tyr、T rp、M et、Lys、Cys和H is是引起多肽具有抗氧化活性的氨基酸[43]，酸奶中抗氧化肽至少含有一个Pro残基，部分肽N端为疏水性氨基酸如Val、Leu，且肽段序列中含有Pro、H is或Tyr[7]。Parmigiano-Reggiano干酪水溶性肽的抗氧化活性主要与其肽段中的Tyr、M et和T ry有关[4]。

Cheddar干酪中分子量超过10 ku的多肽对DPPH具有较好清除作用[16]，不同凝乳酶干酪中分子量小于3 ku的多肽都具有抗氧化作用，且主要源自αs1-酪蛋白[32]。比较了4℃成熟120 d C rem a de Chiapas干酪中分子量在3～10 ku和小于3 ku的水溶性多肽的抗氧化活性，发现分子量3～10 ku的肽的抗氧性是分子量小于3 ku的多肽的2.5倍[44]。

肽的连接方式和特殊结构特征也影响肽的抗氧化性。Saito曾报道三肽中氨基酸位置的任何改变将导致肽呈现不同抗氧化性[45]。绵羊和山羊乳干酪中发现了源自β-酪蛋白的Tyr-G ln-G lu-Pro-*肽段具有抗氧化活性[38]。添加了附属发酵剂干酪乳杆菌（Lactobacillus casei ssp.casei 300）的Cheddar干酪中发现了抗氧化作用较强的肽，分别源自β-酪蛋白的VKEAM APK和αs1-酪蛋白的H IQKEDVPSER，其中VKEAM APK的抗氧化作用与商业抗氧化剂BHA相当[3]。Gouda干酪HPIKHQGLPQ水溶性肽分解为HPIL和HGGLPG后抗氧化能力与同剂量的儿茶总素相同[7]。

5 展 望

干酪种类繁多，富含蛋白质，是营养价值高的多功能性食品。由于干酪成熟过程中乳酸菌的存在，干酪为抗氧化肽的产生提供了良好基质。近年来,随着消费者持续对生活质量提高的关注和高端乳制品的发展趋势，应进一步探索干酪抗氧化肽的形成机理，分离、鉴定干酪中抗氧化肽，开发出具有抗氧化肽含量高和抗氧化活性强的干酪产品，这对于延缓机体衰老，提高机体抗氧化能力，促进乳制品的换代升级、提升乳品行业的发展水平具有重要积极作用。