乳酸菌胞外多糖的分类及生物活性研究进展

文/黄承敏 陈 绮 游善兵 姚 慧 肖 茜 刘成国 周 辉＊

（1 湖南农业大学食品科技学院；2 湖南南山牧业有限公司）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是能够利用可发酵糖，产生大量乳酸的细菌的统称。作为公认安全的益生菌，LAB可促进肠道有益微生物的生长，对腹泻、肠易激综合征、过敏、乳糖不耐受、刺激反应等均有一定的治疗功效[1]，因而在工业、农业、医学等领域有着重要的应用价值。许多LAB的益生作用与其所产生的胞外多糖关系密切。胞外多糖（Exopoly Saccharides，EPS）是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、渗透到培养基中、易与菌体分离的一类多糖类化合物，对微生物的生长有着重要意义[2]。许多LAB的益生作用与其产生的EPS关系密切。

1 乳酸菌胞外多糖的分类

根据存在位置的不同，LAB EPS可以分为荚膜多糖和粘多糖两类，但这两类多糖结合在一起很难区分[3，4]。根据化学组成的不同，LAB EPS可分为同型多糖和杂多糖两类。同型多糖是由1 种单糖组合而成的EPS，杂多糖则是由多种单糖组成的3～8 个重复单元所构成。大多数LAB所产生的EPS都是杂多糖，但在过去10 年，同型多糖却是研究最为广泛的一类EPS[5，6]。

2 LAB EPS的化学组成

EPS的主要组成成分是碳水化合物和蛋白质，也有一些EPS中还含有脂类、核酸或一些无机成分，这与EPS的分离纯化方法和菌株的来源密不可分[7]。

同型多糖仅由1 种单糖聚合而成，故其组成成分较杂多糖更为简单。同型多糖之间的差异主要体现在主链连键、分子量和侧链结构等一级结构的不同，平均分子量通常在1.0×107Da左右。葡聚糖和果聚糖是其中最常见的两种成分，通常由一个主链和不同分支度的支链构成。根据碳元素结合位点的不同，同型多糖可以分为α-D-葡聚糖、β-D-葡聚糖和β-D-果聚糖三种类型[8，9]。

与同型多糖相比，杂多糖的化学组成和结构则更为复杂，产量也更低。杂多糖的生物合成是在细胞质中进行的，分子量在1.0×104～1.0×106Da之间。线性或支链的单元组成了杂多糖，而这些基本的重复单元又是不同的单糖在酶的作用下通过α或β-糖苷键连接组成，如半乳糖、鼠李糖或葡萄糖。杂多糖有时会混有N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺或葡糖醛酸，甚至还可能存在磷酸基、乙酰基和甘油等其他糖残基[10，11]。EPS的结构与其功能有着密不可分的联系，分子量、重复单元和单糖组成、糖苷键连接类型、化学基团等因素是影响其功能的关键因素[12]，但对于何种结构决定何种功能则研究较少。

3 LAB EPS的生物活性

目前已有研究报道，LAB所产EPS具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等生物活性。

3.1 抗肿瘤活性

肿瘤的发生会经过一个复杂、多阶段的过程，遗传因素和机体自身免疫功能低下是其发生的主要原因。1982年Shiomi等[13]研究发现EPS具有抑制肿瘤活性后，就成为了众多学者研究的热点。

Oda等[14]研究表明，瑞士乳杆菌约古特亚种所产EPS具有抗肿瘤活性，其肿瘤抑制的主要机制是通过宿主介导的免疫应答而实现的。Vinderola等[15]发现马乳酒样乳杆菌具有抗菌、促进伤口愈合和抑制肿瘤生长等作用。Lee等[16]经过对双歧杆菌丁醇提取物进行抗肿瘤活性分析，发现来自于青少年双歧乳杆菌的肽聚糖、多糖片段和糖蛋白都具有肿瘤抑制作用，突出表现在对结、直肠癌的预防作用。 Ruas-Madiedo等[17]在研究乳酸乳杆菌乳油亚种KVS20的抗肿瘤活性时发现，向荷肉瘤小鼠S180腹腔中注入含有该菌EPS的菌体冻干物后，产生了抗癌效果，但只注射菌体则没有此效果。

刘宇等[18]研究发现，德氏乳杆菌保加利亚亚种OLL1073R-1所产EPS不但具有调节胃肠道菌群组成、抗高血压、降胆固醇等生理作用，还可以调节宿主抗肿瘤活性。邢书涵等[19]从藏灵菇中筛选出了一株产EPS的干酪乳杆菌KL1，将其所产EPS进行纯化后研究其对HCT-8人结肠癌细胞的增殖抑制和诱导细胞凋亡作用。结果表明，纯化后得到的单一组分EPSa具有阻碍HCT-8细胞增殖的作用，且细胞生长抑制率呈时间-剂量依赖关系。对细胞凋亡情况的探究发现，EPSa处理组的凋亡细胞明显高于对照组，由此判断，藏灵菇源干酪乳杆菌KL1菌株所产单一多糖EPSa可诱导HCT-8发生细胞凋亡，从而阻碍HCT-8细胞的增殖。

恶性肿瘤医治的惯用有效方法为手术、放疗、化疗等，但这些手段往往在杀伤癌细胞的同时，还会对人体的正常组织产生毒性，造成许多严重的副作用。减少机体毒副作用、保护机体的正常免疫功能和杀伤肿瘤细胞在肿瘤疾病治疗过程中具有同等重要的意义[20]。药理及临床试验证明，EPS是一种可以作为免疫调节剂的化合物，能激活机体自身的免疫功能，且EPS自身具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等特点，使其应用于癌症的辅助治疗中，为肿瘤的治疗提供了更安全的手段[21]。

3.2 抗氧化活性

相关研究发现，肿瘤细胞的形成和恶性转移与过氧化紧密相关，所以EPS的抗氧化活性与肿瘤抑制活性也有着十分密切的联系。具有高水平抗氧化作用的EPS一般也具有一定的肿瘤抑制活性，这或许是由于决定EPS抗氧化活性的特定结构与抗肿瘤活性的结构相似而产生的[22，23]。Kanmani等[24]研究发现，乳酸链球菌PI80代谢产生的EPS在体外对羟自由基和超氧化由基具有较强的清除能力。Xu等[25]对动物双歧杆菌RH（Bifidobacteriumanimalis RH）所产EPS进行分离纯化，得到一种重要的EPS组分EPSa，并发现当EPSa片段浓度达到0.2 mg/mL时，对1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）的清除能力与0.25 mg/mL的维生素C（VC）相当；且EPSa对脂质过氧化的抑制活性、对羟自由基（OH）及超氧阴离子自由基（O2-）的清除能力都明显高于VC。

颜炳祥等[26]研究了硒化EPS的抗氧化能力，结果表明，硒化的EPS总抗氧化能力及对OH的清除活性较强，但对O2-的清除活性与未硒化的EPS相比，变化相差不大。熊强等[27]研究表明，来自植物乳杆菌Z22酸性多糖EPS-S和中性多糖EPS-Z都具有较好的自由基清除活性。其中EPS-S对DPPH的清除能力为27.75%，对OH的清除能力为66.16%、对O2-的清除能力达58.00%；而EPS-Z对这3 种自由基的清除率分别为24.02%、59.03%和45.20%，结果表明，酸性多糖比中性多糖具有更强的抗氧化能力。

蔡秋杏等[28]研究了腌干鱼来源的LAB，发现LAB菌株的抗氧化能力越强，其在细胞内的抗氧化酶活性也越高，同时该菌株EPS产量、纯度也更高，抗氧化能力也更强。刘雯雯等[29]在研究植物乳杆菌-12所产EPS对HT-29细胞增殖的抑制作用时发现，对HT-29细胞的抑制效果随着EPS浓度的增加而增大；在植物乳杆菌-12 EPS的抗氧化试验中发现，DPPH清除率与EPS浓度呈依赖关系，当浓度为0.5 mg/mL时，DPPH清除率能达到49.13%；在细胞凋亡试验中，EPS浓度为500 μg/mL时，HT-29细胞凋亡数可达50.3 个。

3.3 免疫调节活性

大量研究表明，EPS具有免疫调节作用，能够提高T淋巴细胞、B淋巴细胞的增殖能力，诱导细胞因子产生，并激活巨噬细胞的吞噬能力等[30]。然而并不是所有的EPS都具有免疫活化功能，其免疫活性因LAB菌株属性的不同而有所差异，这种差异对活性EPS的结构也有影响。EPS的结构特点与免疫调节特性的关系主要表现在两个方面：首先，含有负电荷侧链结构的酸性杂多糖对免疫反应有很好的诱导作用；其次，体积或分子量大的杂多糖会抑制免疫反应的发生[31]。例如，酸性LABEPS的组成中含有磷酸根基团，所以大多能够诱导免疫应答；敲除了EPS合成基因后，EPS较高分子量的天然EPS能够更加有效的诱导TNF-α、IL-12、IL-10和IL-6等细胞因子的产生[32]。

李伟欣等[33]研究了一种双歧杆菌代谢产生的EPS的免疫调节功能。结果显示，低剂量的EPS可以诱导小鼠脾淋巴细胞增殖，并显著提高小鼠血清半数溶血值HC50，增强小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬能力，表明此双歧杆菌代谢产生的EPS对动物体内的特异性和非特异性免疫都有增强效果，具有一定的免疫调节活性。Ruas-Madiedo等[34]研究发现，动物双歧杆菌亚种（B. animalis ssp.）lactis A1、IPLA-R1、长双歧杆菌（B.longum）、NB667和鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus GG）的EPS在1 mg/mL时能够抵御体外真核细胞的细胞毒素，保护人体不受病原菌侵害。Kitazawa等[35]研究表明，分离自双歧杆菌发酵液的EPS表现出较高的淋巴细胞免疫应答促进作用；保加利亚乳杆菌OLL1073R代谢产生的酸性EPS可以促进小鼠B淋巴细胞的有丝分裂。

4 展望

LAB作为发酵食品中常见的微生物，一直是食品微生物方向的研究热点。随着大量的LAB EPS被分离和鉴定，其生物活性不断被揭示，在未来将会得到更广泛的应用。目前困扰LAB EPS开发应用的关键问题是如何提高其产量，更好地降低EPS的生产成本。例如，采用一些物理、化学的诱变方法来筛选高产的突变体，增加EPS的产量。此外，基于对LAB EPS生物合成机制的认识，利用基因工程技术构建高产EPS的工程菌株，也是促进EPS工业化生产和应用的有力手段。另一方面，LABEPS的组成存在很大的差异性，即使同一种LAB，其代谢产生的EPS也存在菌株特异性。未来需要建立EPS组成与生物活性之间的构效关系，用于EPS的人工设计，更好地促进LAB EPS在食品、医药领域的应用。