LncRNAs在细胞衰老中的作用和治疗靶标

戴凯琴，刘 俊，凌 霜，许锦文

(上海中医药大学交叉科学研究院穆拉德中药现代研究中心，上海 201203)

细胞衰老是一种稳定的增殖性停滞状态，这种不可逆的细胞停滞状态可能由多种因素引起，如端粒缩短、癌基因诱导或氧化应激。除此之外，不同的细胞类型中，细胞衰老的形态和分子特征有所不同，例如明显的扁平状态，溶酶体β-半乳糖苷酶的活性增加，laminB1表达降低以及炎性因子的表达增加。虽然许多因素参与细胞衰老，但p53/p21和p16/Rb是不同细胞类型中细胞衰老的两个主要调节途径。衰老是一个复杂的生物过程，引发与年龄有关的诸多疾病，如心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病、癌症。随着表观遗传学的深入研究，人们越来越认识到长链非编码 RNA(long non-coding RNAs，LncRNAs)显示出高度的细胞和组织特异性，以及其作为细胞中调节因子的作用。本文将深入探讨LncRNAs在细胞衰老中的作用机制。

1 LncRNAs

非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)是指不编码蛋白质的RNA，除广为人知的核糖体RNA(ribosomal RNA, rRNA)、转运RNA(transfer RNA, tRNA)外，还包括小核RNA(small nuclear RNA, snRNA)、小核仁RNA(small nucleolar RNA, snoRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA) 等多种已知或未知功能的RNA。这些RNA的共同特点是可在基因组中转录，但是不翻译成蛋白，如人基因组中50%～70% DNA可被普遍转录，但却只有约2%形成蛋白质。基因组学早期研究认为，除rRNA、tRNA之外的ncRNA是基因组转录的噪音，为RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ，RNA Pol Ⅱ)转录的副产物，不具有生物学功能。但随着人们对ncRNA的认识逐渐深入，很多非编码RNA，包括miRNA、LncRNA以及环状RNA(circular RNA，circRNA)等均具有调控功能，参与重要且复杂的生物学过程。此外，ncRNA的高比例可能与物种调控水平的复杂性有关，如ncRNA在原核生物基因组中比例小于25%，植物和后生动物中比例大于60%，人类中ncRNA比例最高，约为98.5%，这说明ncRNA比例越高，生物调控的复杂度也更高。

2 LncRNAs参与细胞衰老的机制

在衰老过程中，已发现许多LncRNAs的表达受到明显的影响。多因素参与细胞衰老， p53/p21和p16/Rb是不同细胞类型中细胞衰老的主要调节途径。细胞衰老作为一种强大的肿瘤抑制机制已经被广泛研究，以抵抗致癌基因的出现。本文主要探讨与衰老相关的LncRNAs的研究，主要针对特殊的衰老途径(p53/p21和p16/Rb)和染色体端粒。

2.1与端粒相关的LncRNAs复制衰老与端粒长度的逐渐缩短有关。非编码端粒重复RNA (telomeric repeat containing RNA, TERRA)是由 RNA Pol Ⅱ将端粒从亚端粒区域转录而成，已被证明可以调节端粒的长度。最近的研究表明，TERRA具有引发早期衰老和端粒重组的独特功能。在THO复合突变体中，转录的TERRA能侵入双链体端粒DNA以形成DNA-RNA杂合，抑制染色体端帽形成和保护端粒末端外切核酸酶1(exonuclease 1, Exo1)，从而诱导端粒缩短[1]。然而，在没有端粒酶、THO复合突变体的情况下，TERRA和端粒之间产生的R环并诱导端粒重组，从而延缓衰老[2]。研究也表明，酿酒酵母端粒酶RNA(telomerase component 1, TLC1)是拥有3个支臂的灵活支架，TLC1中的EST1臂结构域通过异源RNA蛋白结合模块，将端粒酶催化亚基1(ever-shorter telomeres 1,Est1)与端粒结合蛋白(cell division control 13, Cdc13)连接起来，相互作用招募端粒酶到端粒；除此之外，第2个必需的Est1臂结构域(second essential Est1-arm domain，SEED)可能在Est1-Cdc13介导的端粒酶募集到端粒后，在端粒酶介导的端粒延伸中发挥重要作用[3]。

2.2与p53/p21途径相关的LncRNAs许多因素调节p53/p21衰老途径，包括转录因子、RNA结合蛋白和microRNA，如p53、p21、人抗原R(human antigen R, HuR)、Myb结合蛋白1A(Myb-binding protein 1A, MYBBP1A)、乳腺癌缺失基因1(depleted in breast cancer 1, DBC1)、miR-22和miR-424。已经报道了一些LncRNAs以不同的方式调节p53/p21途径。下面主要讨论LncRNAs通过转录和转录后基因表达对此途径的影响。

2.2.1在转录过程的作用 LncRNA-pint(p53 induced noncoding transcript, pint)是由p53诱导，调节细胞活力和增殖的LncRNA。Pint与PRC2直接相互作用，是PRC2靶向组蛋白H3上赖氨酸27的三甲基化(trimethylation of lysine 27 on histone H3, H3K27me3)所必需的。在存在DNA损伤的情况下，Pint作为细胞周期停滞的负调节剂，并作为促生存分子，通过负调节p53活性而负反馈调节整个p53途径[4]。LncRNA-PR-LncRNA-1(p53-regulated lncRNA 1, PR-LncRNA-1)主要位于细胞核，直接受p53调控。在DNA损伤的情况下，PR-LncRNA-1通过蛋白质-RNA相互作用，与Sam68(src-associated substrate during mitosis of 68 ku, Sam68)作用，有效地向p21启动子募集p53，促进p21的转录，调节细胞周期。这些发现提示了一种正反馈机制，PR-lncRNA-1是重要的Sam68相关的RNA，与Sam68/p53启动子募集至关重要[5]。

2.2.2在转录后的作用

2.2.2.1与前mRNA的剪接相关的LncRNAs 由p53诱导的PANDAR参与B细胞淋巴瘤/白血病-X短链(B-cell leukaemia/lymphoma-X short, BCL-XS)mRNA可变剪接的调节。在正常PANDAR表达的细胞中，聚嘧啶束结合蛋白1(partners polypyrimidine tract-binding protein 1, PTBP1)与BCL-XS前mRNA结合，以调节促凋亡BCL-XS mRNA的可变剪接；在具有上调的PANDAR水平的细胞中，PANDAR可以充当PTBP1的诱饵，从而减少BCL-XS mRNA变体，抑制细胞凋亡[6]。

2.2.2.2与蛋白翻译相关的LncRNAs LncRNA-7SL与TP53 mRNA的3′非翻译区(UTR)形成部分杂交体，与HuR之间竞争结合TP53 3′-UTR，降低TP53 mRNA稳定并抑制p53翻译，进而影响p53水平和p53的生长抑制功能[7]。

2.2.2.3与蛋白稳定相关的LncRNAs LncRNA-PURPL(p53 upregulated regulator of p53 levels, PURPL)是一种DNA损伤后直接受p53调控的非编码RNA。RNA结合蛋白HuR作为潜在的接头蛋白，募集PURPL与MYBBP1A结合，并抑制p53-MYBBP1A复合物的形成。在没有PURPL的情况下，MYBBP1A与p53相互作用并稳定p53。沉默MYBBP1A明显挽救PURPL缺陷细胞中的基础p53水平和增殖，表明MYBBP1A介导PURPL在调节p53中的作用。证明了PURPL在维持基础p53水平中的作用，p53-PURPL自动调节反馈回路[8]。LncRNA-DINO(damage induced noncoding, DINO)是一种保守的CDKN1A上游LncRNA，也是DNA损伤反应(DNA damage response, DDR)的一个新的组成部分。在没有DNA损伤的情况，环己酰亚胺追踪结果显示，p53蛋白在对照细胞中快速降解；而当人或小鼠过表达DINO时，p53稳定化和p21蛋白水平均增加。DINO通过直接结合p53并稳定p53蛋白，介导p53自身扩增环。DINO可以产生具有其同源转录因子的反馈环以扩增细胞信号传导网络[9]。

2.2.2.4与蛋白活化相关的LncRNAs LncRNA-MALAT1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript1, MALAT1)首次在非小细胞肺癌中被发现，MALAT1在癌症中起重要作用，作为各种基因的转录调节因子，包括涉及细胞增殖、迁移和转移的基因。MALAT1与含有LZ结构域的DBC1的aa120-280区域结合，从而阻断信息调节因子2相关酶1(Sirtuin 1, SIRT1)和DBC1之间的相互作用，增强SIRT1的脱乙酰活性，影响其下游靶基因谱的转录。p53转录激活许多基因并诱导细胞周期停滞、细胞衰老[10]。

2.2.2.5与microRNA相关的LncRNAs LncRNA-GUARDIN是一种p53诱导型效应子，GUARDIN在DNA修复和防止端粒损伤中具有重要作用。GUARDIN作为具有吸附miRNA-23a作用的分子海绵(molecular sponge)，通过竞争性结合miR-23a，促进端粒重复结合因子2(telomeric repeat binding factor 2, TRF2)表达，防止端粒末端损伤。因此，GUARDIN沉默引发细胞凋亡和衰老[11]。LncRNA-OIP5-AS1(Opa interacting protein 5 antisense transcript 1, OIP5-AS1)是一个与HuR相互作用的新转录本，抑制多种恶性肿瘤细胞增殖。HuR结合OIP5-AS1并稳定此LncRNA，反过来，OIP5-AS1又作为HuR的海绵。miR-424与OIP5-AS1相互作用，并与HuR竞争结合OIP5-AS1。降低HuR能增强miR-424与OIP5-AS1的结合；而miR-424的过表达降低了HuR与OIP5-AS1的结合，进而释放HuR以结合编码增殖蛋白的靶mRNA(TP53、Stir1等)。以这种方式，miR-424和HuR竞争结合OIP5-AS1来调控HuR与mRNA的结合，从而影响HuR诱导的增殖表型[12]。

2.3与p16/RB途径相关的LncRNAs已经报道的一些LncRNAs，以不同的方式调节p16/RB途径。大多数LncRNAs都起着转录调节因子的作用，通过与特定的染色质修饰或转录因子结合，抑制或激活转录。迄今为止，关于p16/RB途径细胞质中的LncRNAs分子机制研究比较少。

2.3.1在转录过程的作用 LncRNA-ANRIL(CDKN2B antisense RNA 1, CDKN2B-AS1/ANRIL)是从CDKN2B基因座以反义方向转录的。ANRIL通过募集PRC1的组成成分色素框同源蛋白7(chromobox 7, CBX7)，增加H3K27甲基化，促进CDKN2A/CDKN2B基因座的表观遗传沉默，从而抑制细胞衰老[13]。LncRNA-MIR31HG(MIR31hostgene, MIR31HG)位于9号染色体上INK4A基因座上游400 kb处，MIR31HG下调可以减少细胞生长，并且促进强烈的衰老表型。在正常条件下，MIR31HG位于细胞核和细胞质中。核MIR31HG与复合物PRC1和PRC2相互作用以抑制p16INK4A表达；在癌基因诱导的衰老后，MIR31HG被高度上调并输出到细胞质中，从而减轻CDKN2A基因座的抑制[14]。LncRNA-VAD(vlinc RNA antisense to DDAH1，VAD)在癌基因诱导的衰老中上调，激活CDKN2A基因座的转录，并促进衰老。VAD通过抑制H2A组蛋白家族成员Z(H2A histone family, member Z, H2A.Z)，与INK4基因座的结合，激活INK4基因座细胞周期抑制剂的基因表达，从而促进p16和p14的表达[15]。

2.3.2在转录后的作用 LncRNA-UCA1(urothelial cancer associated 1, UCA1)在膀胱癌及其他癌症中上调。UCA1是CAPERα/ TBX3抑制的直接靶标，其过表达可诱导衰老。在增殖细胞中，CAPERα/TBX3蛋白复合物阻止UCA1 RNA的产生，人异质性胞核核糖核蛋白A1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, hnRNPA1)结合并使CDKN2A-p16INK mRNA不稳定；而在衰老期间，CAPERα/TBX3复合物分离，UCA1上调并隔离hnRNPA1，因此稳定CDKN2A-p16INK[16]。

2.4与其他衰老特征相关的LncRNAsLncRNA-DDSR1(DNA damage-sensitive RNA1, DDSR1)在DNA损伤时以ATM-NF-κB途径依赖性方式诱导。DDSR1缺失损害细胞增殖和DNA损伤应答信号，并通过同源重组(homologous recombination，HR) 降低DNA修复能力。DDSR1通过与异质核核糖核蛋白U样蛋白1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U like 1, hnRNPUL1)之间的相互作用，来调节乳腺癌1型易感蛋白(breast cancer type 1 susceptibility protein, BRCA1)和受体相关蛋白80(receptor-associated protein 80, RAP80)进入DNA双链断裂位点，从而调节HR[17]。LncRNA-HOTAIR(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)是位于12号染色体上HOXC簇中的LncRNA，并调节2号染色体上的HOXD基因簇。HOTAIR通过降低Iκ-Bα(NF-κB抑制剂)，调节NF-κB的活化，并在DNA损伤期间诱导持续的NF-κB活化和NF-κB靶基因的表达。NF-κB-HOTAIR轴在DDR期间驱动正反馈环级联反应，并有助于卵巢癌和其他癌症的细胞衰老和化疗耐药[18]。LncRNA-Zeb2-NAT是Zeb2的天然反义链，其控制锌指盒装E型盒装同源盒2(zinc finger E-box-binding homeobox 2, Zeb2)的表达。Zeb2-NAT调节小鼠成纤维细胞和胚胎干细胞的ZEB2蛋白质的表达。降低Zeb2-NAT RNA的水平，有利于OSKM诱导的老年细胞全能干细胞的产生。此外，还发现当胚胎干细胞接受信号时，Zeb2-NAT表达迅速上调，并且阻断Zeb2的表达，从而影响胚胎干细胞的自我更新和多能性[19]。

3 以LncRNAs为靶点的治疗

ncRNAs在细胞发育和代谢中呈现功能多样性，它们通过多靶点、多途径调节基因表达的各个方面，包括染色质重塑、转录、加工和转录后修饰[20]。LncRNAs显示出强的组织特异性，可能成为某些疾病的新治疗靶点，目前研究主要集中癌症治疗。LncRNA-CLMAT3(colorectal liver metastasis associated transcript 3, CLMAT3)的过表达与结肠直肠肝转移明显相关，并且是结直肠癌患者存活率差的独立预测因子。CLMAT3敲低增强钙黏蛋白1(cadherin 1, Cdh1)表达，并通过增加S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase associated protein 2, Skp2)蛋白泛素化，导致p27Kip积累，从而使细胞周期停滞在G0/G1期，控制细胞增殖[21]。LncRNA-HOXA-AS3(HOXA cluster antisense RNA 3, HOXA-AS3)在肺腺癌组织和A549细胞中明显上调。HOXA-AS3通过形成RNA双链体，增加了HOXA6 mRNA的稳定性。敲除HOXA-AS3后，细胞增殖、迁移和侵袭受到抑制。同时，HOXA-AS3与NF110结合，调节HOXA-AS3的细胞定位。HOXA-AS3在肺腺癌中被激活，并促进癌细胞发展。因此，HOXA-AS3可能成为肺腺癌的有效治疗靶点[22]。

最近研究表明，实现RNA为生物活性小分子药物靶点的长期目标是可能的。比如，新发现的1个与miR-54结合的萘啶类小分子化合物，抑制逆转肿瘤细胞的缺氧生理反应，导致肿瘤细胞凋亡，其生物学效应比miRNA拮抗剂2′-O-甲基RNA浓度低25倍，并具有选择性[23]。由于长链非编码RNA只有少数被纯化，因而定量LncRNA蛋白相互作用是一种可行的分析靶向LncRNA小分子的有效方法[24]。最近研究报道，运用高通量筛选方法，发现Ellipticine能够靶向LncRNA BDNF-AS与组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶相互作用[25]。尽管目前这类药物发现还不多，但靶向RNA的小分子药物是一种新的药物开发趋势。

4 小结

近年来，LncRNAs由于其多种生物学功能和作为新型治疗靶点的潜力而一直处于分子生物学的前沿。因此，我们已经开始了解其分子功能，以及这些过程如何影响疾病的发展。随着年龄的增长而出现的许多疾病，包括肥胖、糖尿病、衰老体虚、癌症和神经变性，其特征在于表达的转录物的模式改变。正如本综述所讨论的，LncRNA在p53/p21和p16 衰老途径中，可通过转录和转录后调控过程调节蛋白质。由于LncRNAs的保守性很差，从而限制了从动物模型到人类临床发展。衰老细胞中LncRNAs的研究还处于起步阶段，许多问题仍然存在于这些转录本影响细胞功能的程度，以及它们是否能够成为相关疾病的治疗靶点(如癌症、神经变性、动脉粥样硬化等)，还需要进一步的深入研究。