复方蜚蠊提取物对大鼠溃疡性结肠炎肠道菌群的影响

段晓梅，闫 爽，倪连丽，耿福能，刘 彬，刘 衡，张成桂，李 玥

(1. 大理大学云南省昆虫生物医药研发重点实验室，药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心，云南 大理 671000；2. 药用美洲大蠊四川省重点实验室，四川 成都 610000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)与人体肠道菌群的组成和改变密切相关[1]。复方蜚蠊提取物PA、PB、PC[P4]中的君药蜚蠊学名美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)，有促进组织修复、调节免疫的作用[2-3]。本实验研究复方蜚蠊提取物对慢性UC大鼠肠道菌群的影响。

1 材料

1.1实验动物SPF级SD大鼠96只，♀♂各半，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2016-0004，饲养于大理大学动物中心。

1.2仪器StepOne Plus RT-PCR型实时荧光定量PCR仪(ABI公司)；DYY-12型电泳仪(北京市六一仪器厂)；InGenius型凝胶成像分析系统(SYNGENE公司)；NANODROP2000型核酸蛋白分析仪(Thermo公司)。

1.3药物与试剂复方蜚蠊提取物(云南省昆虫生物医药研发重点实验室提供)；粪便基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)；SYBR Green I荧光定量PCR预混液UNG(含ROX)、DNA分子量标准Marker(GenStar)。抗原乳化液[2]：取家兔结肠抗原，生理盐水溶解后，加入等量完全弗氏佐剂制成。

1.4荧光定量PCR引物分别以硫酸盐还原菌特有的功能酶基因序列，拟杆菌属、双歧杆菌属、乳酸杆菌属、大肠埃希菌种、肠球菌属及总菌群的16S rDNA基因序列，设计菌种特异性PCR引物[3](Tab 1)，引物由上海生工生物工程公司合成。

Tab 1 PCR primer sequence of intestinal flora

2 方法

2.1动物模型的制备与给药参照文献[2]的方法造模，大鼠随机分为正常组、模型组、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine, SASP)组(300 mg·kg-1)、复方蜚蠊提取物PA、PB、PC高、中、低剂量组(200、100、50 mg·kg-1)，正常组和模型组灌肠给予生理盐水2.5 mL·kg-1，其余各组灌肠给予相应药物(2.5 mL·kg-1)，每日给药1次，连续给药14 d。

Tab 2 Quantitative results of intestinal flora (lg of copies, n=8)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel;△P<0.05,△△P<0.01vsSASP

2.2粪便采集与病理学观察末次给药后24 h，收集结肠粪便。HE染色制作结肠病理切片，光学显微镜下观察。

2.3粪便DNA的提取所有粪便采用粪便基因组DNA提取试剂盒提取，按照说明书操作。

2.4标准曲线的制作复苏、扩增菌液，提取质粒作为PCR的标准品，用核酸蛋白分析仪检测260 nm波长下的OD值及浓度，用于制作标准曲线。

2.5实时荧光定量PCR反应将待测粪便样本中提取的DNA进行PCR反应。根据熔解曲线，分析PCR产物的特异性，并由StepOne Plus PCR仪分析定量结果。

3 结果

3.1结肠黏膜病理学观察在显微镜下观察大鼠结肠组织病理切片，可见正常组大鼠结肠的结构完整清晰；造模组大鼠结肠黏膜上皮出现破损、杯状细胞大量丢失，黏膜层炎性细胞浸润，提示造模成功。

3.2粪便细菌的定量结果每个粪便DNA样本所含细菌拷贝浓度可通过标准曲线比较得到，由PCR仪得出定量结果(Tab 2)，各组大鼠粪便样本总菌群数量差异无显著性；与正常组相比，UC模型组双歧杆菌、乳酸杆菌数量明显减少(P<0.05)，大肠埃希菌、肠球菌与硫酸盐还原菌数量有增加趋势。

4 讨论

肠道菌群对于维持肠道内环境稳定起重要作用，肠道中菌群发生紊乱，容易导致很多肠道炎症性疾病发生[4]。本研究发现，复方蜚蠊提取物PA、PB、PC作用于UC大鼠可使肠道中双歧杆菌、乳酸杆菌数量有不同程度增加，而PA、PC作用于UC大鼠可使具有条件致病性的大肠埃希菌、肠球菌、硫酸盐还原菌数量有不同程度减少，提示复方蜚蠊提取物对调节肠道菌群具有一定作用，对维持肠道黏膜的平衡有一定的意义。本研究建立了稳定的UC大鼠模型及合适的肠道微生态干预药物评价指标，为UC治疗药物的后续研究奠定了基础。

(致谢：本实验在大理大学昆虫生物医药研发科技创新平台完成，感谢对实验给予帮助的老师和同学！)